[发明专利]表达和分泌系统

说明书

本发明提供了表达和分泌系统，以及使用它们的方法，用于在原核细胞中表达和分泌一种融合蛋白质并且在真核细胞中表达和分泌第二种融合蛋白质。在本文中还提供了核酸分子、载体以及包含此类载体和核酸分子的宿主细胞。

相关申请的交互引用

本申请要求2012年7月5日提交的美国临时申请号61/668397、2013年3月15日提交的61/852483和2013年5月3日提交的61/819063的优先权的权益，所述全部专利申请在本文中以其整体引入作为参考。

发明领域

本发明涉及表达和分泌系统及其使用的方法，用于当核酸转化到用于噬菌体展示的原核细胞时表达和分泌一种Fab融合蛋白质，并当核酸转染到用于表达和纯化的真核细胞时表达和分泌不同的或者相同的Fab融合蛋白质。在本文中还提供了核酸分子、载体以及包含此类载体和核酸分子的宿主细胞。

发明背景

多肽或蛋白质在丝状噬菌体颗粒上的噬菌体展示是允许从多种肽或蛋白质的大型库中挑选具有期望特性的肽或蛋白质的体外技术(McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Sidhu等人,CurrentOpinion in Biotechnology,11:610-616(2000)；Smith等人,Science,228:1315-1317(1985))。可将噬菌体展示用于在丝状噬菌体颗粒的表面展示肽或蛋白质(包括抗体片段如抗体研发领域的Fab)的不同文库，然后挑选与特定的目的抗原结合的。可以通过将抗体片段的基因与噬菌体外壳蛋白的基因融合，将抗体片段展示在丝状噬菌体颗粒的表面上，产生在其表面展示编码的抗体片段的噬菌体颗粒。该技术允许从大型噬菌体文库中分离与多种抗原具有期望亲和力的抗体片段。

对于基于噬菌体的抗体研发，在功能测定法(例如目标结合、基于细胞的活性测定、体内半衰期等)中评价挑选的抗体片段及其同源IgG的特性需要通过从用于噬菌体展示的载体中分离编码HC和LC的DNA序列，并亚克隆到用于IgG表达的哺乳动物表达载体中，来将Fab重链(HC)和轻链(LC)序列重新格式化成全长IgG。亚克隆数十或数百个挑选的HC/LC对的费力方法代表了基于噬菌体的抗体研发方法的主要瓶颈。此外，一旦重新格式化，由于在最初的筛选测定中相当比例挑选的Fab没有令人满意地施行，那么增加进行该重新格式化/筛选方法的克隆的数目将极大地增加成功的最终可能性。

在本文中，我们描述了表达和分泌系统的产生，用于当转化到大肠杆菌中时驱动Fab-噬菌体融合的表达，并当转染到哺乳动物细胞中时驱动包含相同Fab片段的全长IgG的表达。我们证明，来自鼠结合免疫球蛋白(mBiP)的哺乳动物信号序列(Haas等人,Immunoglobulin heavy chain binding protein,Nature,306:387-389(1983)；Munro等人,An Hsp70-like protein in the ER:identify with the 78kd glucose-regulatedprotein and immunoglobulin heavy chain binding protein,Cell,4:291-300(1986))可以在原核和真核细胞二者中驱动有效的蛋白质表达。使用哺乳动物mRNA剪接，去除在人IgG₁HC的铰链区内插入的含噬菌体融合肽的合成的内含子，我们可以以宿主细胞依赖性方式产生两种不同的蛋白质：用于在大肠杆菌中噬菌体展示的与接头肽融合的Fab片段和哺乳动物细胞中的天然人IgG₁。该技术允许挑选与来自噬菌体展示文库的目的抗原结合的Fab片段，并且可以在不需要亚克隆的情况下，在哺乳动物细胞中后续表达同源全长IgG并纯化。

发明概述