[发明专利]人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年6月8日提交的美国临时专利申请序列号61/657,160的权益，其全文以引用方式并入本文以用于任何目的。

技术领域

本发明在细胞分化领域中。更具体地，本发明公开了肝配蛋白配体和鞘氨醇-1-磷酸作为多能干细胞向内分泌细胞分化的调节因子的用途。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于植入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞诸如例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚层细胞表达多种标记物，诸如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。

到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，Hhex和Sox2鉴定内胚层的前区，而Cdx1、2和4鉴定内胚层的后半部分。

内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这帮助肠管的区域化。这通过多种分泌因子诸如FGF、Wnt、TGF-B、视黄酸(RA)和BMP配体及其拮抗剂来完成。例如，FGF4和BMP促进预定的后肠内胚层中的Cdx2表达并阻遏前基因Hhex和SOX2的表达(2000 Development,127:1563–1567)。WNT信号传导也已显示与FGF信号传导平行工作，以促进后肠发育并抑制前肠命运(2007 Development,134:2207–2217)。最 后，由间充质分泌的视黄酸调节前肠-后肠边界(2002 Curr Biol,12:1215–1220)。

特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管的过程中，肠管变得区域化成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。例如，肠管中区域化的胰腺域显示PDX-1的极高表达以及CDX2和SOX2的极低表达。相似地，高水平的Foxe1的存在指示食道组织；在肺组织中高度表达的是NKX2.1；SOX2/Odd1(OSR1)在胃组织中高度表达；PROX1/Hhex/AFP的表达在肝组织中较高；SOX17在胆道结构组织中高度表达；PDX1、NKX6.1/PTf1a和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；并且CDX2的表达在肠组织中高。上文概括摘自Dev Dyn 2009,238:29–42和Annu Rev Cell Dev Biol 2009,25:221-251。

胰腺的形成起于定形内胚层分化成胰腺内胚层(2009 Annu Rev Cell Dev Biol,25:221-251；2009 Dev Dyn,238:29-42)。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠也产生食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管系统。

胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织产生自胰腺内胚层的分化。

D’Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞(ES)衍生出的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnol 2005,23:1534-1541；美国专利7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF-10和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生出的定形内胚层细胞还可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利公开2005/0266554A1)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利7,993,920和美国专利7,534,608)。

Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利7,033,831)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和激活素A的组合而分化成内胚层(美国专利7,326,572)。然 后将细胞和与EGF或β细胞素(betacellulin)结合的BMP拮抗剂诸如头蛋白(Noggin)一起培养，以生成PDX1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。