[发明专利]使用有机溶剂中的枯草杆菌蛋白酶的侧链被保护的寡肽片段缩合

说明书

本发明涉及酶促合成寡肽的方法。

肽类(尤其是寡肽)具有许多应用，例如作为药物、食品或饲料成分、农用化学品或化妆品成分。

已知寡肽可以在溶液中或者通过高度优化的流程而在固相中化学合成。然而，在化学肽合成、尤其是大规模的化学肽合成中仍然存在一些局限性。例如，大于10-15个氨基酸的肽难以在固相上合成，因为它们有形成三级结构(通过所谓的“疏水塌缩”)的倾向，所述三级结构使得肽延伸非常困难，以使得需要大量过量的试剂和氨基酸构建模块。此外，由于存在大量的相似长度的肽，终产品的纯化通常是成本低效的。因此，多于10个氨基酸的肽通常通过被保护的寡肽片段的固相合成的联合来合成，在所述被保护的寡肽片段的固相合成之后，在溶液中进行化学缩合，例如10+10缩合来制备20个氨基酸的肽。被化学保护的寡肽片段缩合的主要弊端是，除了使用C末端Gly或Pro残基的情况之外，在C末端氨基酸残基的活化中发生外消旋作用。因此，化学保护的寡肽片段缩合策略被限制于使用C末端活化的Gly和Pro残基，或者由于所不期望的非对映异构体的形成而不得不处理非常困难的纯化。相比之下，酶催化的寡肽偶联完全避免了外消旋作用，并相比于化学肽合成具有一些其他的优点。对于工业应用，基于动力学方法的酶促肽类合成概念(即使用活化的羧基组分)是最吸引人的(例如参见Sewald和H.D.Jakubke在“肽类：化学和生物学”，1^st翻版，Wiley-VCH Verlag GmbH出版，魏因海姆2002)。

化学-酶促肽合成可能需要侧链未被保护的寡肽片段的酶促偶联，所述寡肽片段已各自被使用化学合成法、发酵法或通过化学和酶促偶联步骤的结合来合成。已经公开了一些关于侧链完全未被保护的寡肽在水环境下的酶促缩合(Kumaran et al.Protein Science,2000,9,734；et al.Bioorg.Med.Chem.1998,6,891；Homandberg et al.Biochemistry,1981,21,3387；Komoriya et al.Int.J.Pep.Prot.Res.1980,16,433)。然而，在水体系下的这种酶促寡肽片段缩合的主要弊端在于，同时发生寡肽酰胺键和C末端酯的水解，导致低产量和许多副产物。为了降低昂贵的寡肽起始原料和肽类产物的水解的量，通常使用大量过量的寡肽亲核剂(5-10当量)来增加缩合速率，并因此减少水解副反应，从经济角度上看这是一种非常不具吸引力的策略。为了进一步降低水解的量，已经在低水反应混合物中使用有机助溶剂来实施酶促完全未被保护的寡肽片段的缩合，显示了较高的产品收率和较少的水解副反应(Slomczynska et al.Biopolymers,1992,32,1461；Xaus et al.Biotechnol.Tech.1992,6,69；Nishino et al.Tet.Lett.1992,33,3137；Clápes et al.Bioorg.Med.Chem.1995,3,245,Kolobanova et al.Russian J.of Bioorg.Chemistry2000,26,6,369)。因为在这些报道中，需要大量的水用于酶的活性(1-5体积％的水)，所以水解副反应仍然没有被完全消除。为了几乎消除酶促水解副反应，可以使用近乎无水的反应混合物(少于1体积％的水)。然而，在这些条件下，只有非常少的酶是有活性和稳定的(G.Carrea,S.Riva,Fundamentals of Biocatalysis in Neat Organic Solvents,Whiley,2008)，并且在这些有机溶剂中，含有未被保护的侧链官能团的寡肽通常展示出非常小的溶解性或者不溶解。一些报道公开了二肽和三肽在无水有机溶剂中的酶促合成(例如Chen et al.J.Org.Chem.1992,57,6960)，但是没有实施寡肽片段的缩合。尽管近乎无水的溶剂几乎消除水解副反应，但是通常来说许多酶活性丧失，并且因此寡肽偶联反应趋向于非常慢，并且不完全。