[发明专利]用于截留和返回细胞的一次性分离器

说明书

本发明涉及一种用于在连续地或者间歇性地被流过的塑料袋子中截留和返回细胞的一次性分离器，该塑料袋子优选可以在生物反应器外部工作。本发明还涉及一种用于在本发明的生物反应器内部或外部截留和返回细胞的方法。本发明还涉及一种用于制造本发明的分离器的方法。

在制造生物活性物质和药物活性产物时，培养动物细胞和植物细胞具有重大意义。培养经常在营养介质自由悬浮液中经过的细胞要求特别高，因为与微生物相反，这种细胞对机械的剪应力和营养物质供应不足很敏感。

通常间歇性地培养动植物细胞系，其缺点是，由于培养基浓度、产物浓度和生物质浓度不断变化，很难实现最佳地供养细胞。此外在发酵结束时积聚了副产物，例如坏死细胞的组分，这些组分在以后处理时通常必须付出巨额成本予以去除。出于所述原因，但特别是在制造例如会因分解蛋白侵蚀而受损的不稳定产物时，所以要使用连续工作的生物反应器。

采用连续的生物反应器可以达到高的细胞密度，并实现与此相关联的高产率，如果满足如下要求的话：

·低剪切力地充足地给细胞供应培养基、特别是溶解氧；

·彻底消除在呼吸时产生的二氧化碳；

·用于建立高的细胞浓度的有效的低剪切力的防堵塞的细胞截留系统；

·生物反应器和截留系统的长期稳定性(无菌、流体动力特性)。

除了连续的工作方式外，具有有效细胞截留系统的生物反应器例如还可以用于培养具有特别高的细胞密度的预培养物。于是按照重复-分批-模式采用非连续方式使用细胞截留系统，以便提取几乎无生物质的细胞培养物上层清液。然后可以再给预培养物反应器装填新鲜的营养介质，以便采用这种方式使得培养物相比于简单的间歇性工作具备较高的细胞密度。

为了能够在连续工作的生物反应器中达到高的细胞密度(每毫升有两千万个以上的存活细胞)，必须有效地截留细胞。所需的截留度在此取决于细胞的生长率和灌注率q/V(生物反应器单位体积V的介质流量q)。

在过去，提出了各种不同的用于连续工作的生物反应器的细胞截留系统，这些细胞截留系统多数都设置在生物反应器外部。其原因是，为了维护和清洁目的易于够到细胞截留系统。

为了使得特别是因氧气供应不足和在生物反应器外部的二氧化碳去除不彻底导致的细胞受损以及因酶(enzymatisch)侵蚀所致的有效物质失效保持得尽可能小，希望细胞截留系统的工作容积小，相关联地使得细胞滞留时间短暂。

有些膜片式过滤器、设备采用横流过滤原理利用固定的和可移动的膜片进行工作，除此之外，在现有技术中还可以采用特殊的离心器和重力分离器。

在借助膜片式过滤器进行细胞截留的情况下，会观察到沉积物或污垢，它们会阻碍可靠的无维护的长期工作。若膜片表面被足够快速地流过，就可以减少沉积物。这可以在静止式或振动式工作中实现。被振动式流过的膜片系统例如是Refine科技公司的交替式切向流(ATF)系统。但快速地流过膜片表面却与低剪切力的细胞培养的基本前提背道而驰。

用于在离心场中分离细胞的低剪切力的离心器在无维护工作的情况下只能工作数周，因而需要更换离心部件。由此增大了污染的风险。

在培养细胞时主要使用的重力分离器是沉降容器和倾斜通道分离器。相比于简单的沉降容器，大型倾斜通道分离器的优点是，容积大小相对于分离面明显较小。出版物(Henzler，H.-J.，Chemie-Technik，1，1992，3)记载了在倾斜通道分离器中截留细胞，这些倾斜通道分离器可以在逆流、交流和直流中工作。被流过的通道横截面可以设有板或管。专利文献US 5,817,505和EP 0 699 101 B1要求保护倾斜通道分离器在逆流式分离器中用于截留细胞的应用。在WO 2003020919 A2中尤其记载了逆流式和交流式分离器以及与各种不同的用于截留细胞的预分离器(例如旋液分离器)的组合。

倾斜通道分离器通过外部回路与生物反应器连接。为此需要软管管路和泵。

为了减少细胞在重力分离器中的新陈代谢活动和结垢，提出使得细胞培养液在其通至重力分离器的路径上冷却。低温情况下新陈代谢活动减少肯定有益于在生物反应器外部长久地保存细胞。