[发明专利]用于蛋白结晶和生物技术的微孔板和方法的改进

说明书

相关申请的引用

本申请要求美国临时申请S/N 61/617,102的优先权，其申请日为2012年3月29日，其主题内容通过引用结合进本文中。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明属于微孔板的改进，包括那些用于蛋白晶体生长的微孔板。

背景技术

生物科学和生物技术的许多领域使用微孔板进行筛选和其他实验。微孔板一般包括大量的(例如24、96、386或1536个)以一规则(通常为矩形)阵列排列的相同单元格。每个单元格都会包含一个或多个孔或储液器，用于将液体或其它目标样品分配到其中。微孔板通常通过注塑塑料制成。在将样品分配到各孔后，微孔板的顶部通常会密封，使实验不受环境的影响。大多数的微孔板设计符合由生物分子科学学会(SBS)建立的ANSI标准。

微孔板的一特定应用是在结构生物学和X射线晶体学领域，其中，它们用于蛋白、核酸、病毒和其他生物大分子复合物的晶体生长，以及用于探索在不同溶液中的蛋白溶解性。在确定生物大分子结构方面，获得大小和质量合适的晶体用于X射线衍射研究仍然是一大瓶颈。提供晶体生长的溶液条件(pH、盐类型和浓度、蛋白质含量、低温防护剂和其他添加剂的浓度)必须确定，并优化以生产衍射分辨率足以用于确定结构的晶体。

图1显示了一种典型的蛋白结晶微孔板，图1(c)显示了这种微孔板的典型单元格。微孔板中的每个单元格通常具有一个或多个用于蛋白溶液的小孔，以及用于“存储”溶液的大孔。

蒸汽扩散是最常用的方法，用于培养蛋白、病毒和生物分子组件以及可作为药物使用的小分子化合物的晶体生长。在蒸汽扩散生长中，每个储液器孔装有无蛋白溶液，并且一滴蛋白溶液置于一个小孔的底部。然后使用塑料膜将微孔板(以及每个单元格)密封。存储液的典型体积是20-200微升，蛋白溶液的典型体积是0.2-2微升。在任意给定单元格内，储液器和蛋白孔上部空间是相通的，允许蒸汽在它们之间流动。存储液最初的蒸汽压比蛋白液滴小。水从蛋白液滴蒸发并在储液器中冷凝直至蒸汽压达到平衡。蛋白液滴中的水蒸发使其中的蛋白浓度逐渐增加。在有利的环境下,这将导致晶体成核和增长。

一些蛋白结晶板的制造商包括Greiner Bio-One International(奥地利)、康宁(康宁，纽约州)，Art Robbins Instruments(加利福尼亚桑尼维尔)、Hampton Research(加利福尼亚索维耶荷市)、Neuroprobe(马里兰州盖瑟斯堡)和腾泉生命科技有限公司(TTP labtech)(英国)。总共超过200种不同设计可用于晶体板。

高通量蛋白结晶的其他方法正在研究中。例如，富鲁达公司(加利福尼亚旧金山市)和Emerald Biosystems(华盛顿州班布里治岛)具有基于微流体芯片的商业化平台。虽然这些允许少量的结晶，但是这种芯片与传统微孔板相比价格昂贵，它们需要特定的和昂贵的硬件上样，并且芯片-硬件结合在结晶实验设计方面灵活性更低。它们也不符合SBS标准。

最近几年的一个重要的方向是开发使用X射线检验晶体而不用将晶体从其生长的板或设备上移动的方法。液滴被分配到尼龙环中、薄膜上或X射线透明玻璃毛细管中，生长出的晶体直接通过透过膜、环或毛细管的X射线检测而不用移动晶体。Oxford Diffraction(自从被安捷伦收购)开发了一种特殊X射线机器，带有垂直X射线束用于检测在常规SBS微孔板中的晶体。Greiner Bio-One与NatXray(法国)合作开发了具有薄(250微米)窗口的微孔板以降低这类应用中的背景散射。

当前微孔板技术的问题

在液体分配和日常使用时，微孔板是水平放置的。如果现有蛋白结晶微孔板旋转为垂直方向或者如果它们颠倒了，每个单元格内的孔中的内含物将散出并混合。同样，如果板经历急剧加速，也会发生混合。这种混合会破坏实验。在蛋白结晶时，存储液和蛋白溶液的早期混合会导致大量不适合的小晶体析出并成核。因此，目前大多数微孔板必须接近水平放置并轻轻的处理。

这种处理限制了当前模板的使用，原因有如下几种。

第一，由于目前微孔板不能翻转，只能在“坐滴”配置中进行结晶。在重力影响下，在蛋白液滴内部成核的晶体将沉淀到支撑表面上。它们往往粘附到该表面，取回比较困难。如果该板可以翻转到“悬滴”配置，晶体则可沉淀到液滴-空气界面，可以容易的从该处收获晶体进行后续研究。