[发明专利]免疫层析检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制非特异性反应的具有高性能和高灵敏度的免疫层析检测方法。另外，本发明涉及一种通过抑制非特异性反应从而能够迅速、简单且准确地检验/测量样品中的检测对象的检测试剂盒。

更具体而言，本发明涉及一种通过保护被金属纳米颗粒标记的标记物并使其稳定化以对抗干燥处理或干燥状态并抑制非特异性反应，从而迅速、简单且准确地检验样品中的检测对象的方法，其中所述标记物用于对检测对象(待检测物质)进行检测，即，该标记物为一种敏化的金属胶体，其中，金属胶体被与检测对象发生特异性结合的物质敏化。

背景技术

近年来，作为一种基于利用抗体的特异反应性来检测样品液中的抗原的简单且便利的体外诊断试剂盒或便携式诊断装置，用于免疫层析法的试纸型免疫测定法的重要性日益增加，所述免疫测定法不需要对检测样品进行预处理。具体而言，用于病毒或细菌等病原体的检验试剂盒是在普通医院或门诊中广泛使用的常见免疫层析装置。

免疫层析装置的最简单结构为样品添加部位、标记物保持部、判定(检测)部位、免疫层析用多孔支持体和样品吸收部位相互连接的结构。标记物保持部已经通过以下方式生产：用保护性稳定化溶液处理用于检测检测对象的、已被金属纳米颗粒标记的标记物(以下也称作缀合物(conjugate))，然后用所述标记物浸渍或涂布免疫层析用多孔载体，随后进行空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等。

作为保护性稳定化溶液，迄今为止，含有牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质作为保护性稳定剂的那些是已知的，但是存在如下问题：它们不能在干燥状态下长期维持稳定，因而人们已经进行了进一步改善和研究。例如，已经报道了含有酪蛋白、乳清蛋白或酪蛋白分解产物的保护性稳定化溶液(见专利文献1)。

另外，作为对多种免疫测定法中的标记抗体的保护和稳定化，已知如下技术：向金胶体中添加生物分子(例如，抗体等)，然后通过向其中掺入被硫醇基(thiol)和/或二硫基取代的聚乙二醇来保护并稳定该缀合物(即，使颗粒的聚集降至最低并使能够吸附的自由表面饱和)(见专利文献2)。

另外，作为能够以干燥状态长期稳定贮存固相免疫试剂的一种保护性稳定化溶液，已经提出了由20％至80％的糖(如海藻糖)和0.5mol/L至2mol/L的缓冲液组成的保护性稳定化溶液(见专利文献3)。

另外，为了改善含有敏化金属胶体的冻干产品的稳定性，已知如下技术：在将含有敏化金属胶体的溶液冻干时，向其中掺入海藻糖、单精氨酸谷氨酸盐、色氨酸、氯化钙等中一种或多种(见专利文献4)。

另外，作为蛋白质(特别是贮存于水溶液中并在贮存三个月后诊断准确度轻微下降的酶)贮存性优异的体外诊断药物组合物，已经报道了可以通过向其中额外掺入胍(其盐)或精氨酸(其盐或其衍生物)作为稳定剂来解决在水溶液中引起蛋白质聚集、水解等问题(见专利文献5)。

另一方面，关于免疫层析装置，存在以下常见问题：背景着色(判定部处除固定相抗体以外的其他部分的着色)、空白显色(在检测物不存在的情况下固定相的显色)和前带现象(假阴性现象，其中当使用过量的检验物质作为样品时，明显观察到检验物质似乎以较少的量存在)，这些问题不仅在检测时降低SN率，还引起功能异常。

背景着色由可视化的流动相抗体与多孔载体之间的疏水性结合引起，空白显色由具有负电荷的流动相抗体与具有正电荷的固相载体之间的电相互作用引起，这又称作非特异性显色。另外，前带现象认为归因于如下事实：未能与标记物反应的过多检测物质与判定部发生反应，并且被金属颗粒标记的用于检出检测物质的标记物不能与判定部反应。

作为对策，已经从各种角度进行了众多研究。例如，在利用含有pH缓冲剂等的展开液的免疫层析检测方法中，已使用了各种添加剂以用于抑制因生物亲和力所致的副反应或用于抑制非特异性反应，这类添加剂的例子包括：用于促进抗原-抗体反应或用于抑制非特异性反应的蛋白质(例如，牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶等)、高分子化合物(例如，聚乙二醇、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)、非离子型表面活性剂(例如，Tween20、Triton X-100等)、离子型表面活性剂或聚阴离子(例如，硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、透明质酸、硫酸软骨素等)或它们的盐，等等(见专利文献6)。