[发明专利]肿瘤坏死因子受体融合蛋白及其使用方法

说明书

发明领域

本发明涉及嵌合融合多肽，其包含经结合而形成二聚融合蛋白的犬肿瘤坏死因子的细胞外配体结合部分和犬免疫球蛋白Fc结构域多肽。本发明还延及编码所述嵌合融合多肽的多核苷酸、嵌合融合多肽的制备方法，并且还延及其用于治疗或预防炎性疾病特别是TNF相关病症的用途。

发明背景

肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)在功能上表现出明显的重叠。这种相同性使得这些细胞因子被统称为肿瘤坏死因子(TNF)。TNF对介导促炎免疫应答发挥强大的多效性作用，并且还显示出参与控制细胞增殖、分化和凋亡。TNF通过结合I和II型TNF受体(TNFR)来介导这些作用，所述受体是在TNF应答细胞上表达的细胞表面受体。

TNF拮抗剂，如抗TNF抗体、可溶性TNF受体蛋白和TNF受体-Fc融合蛋白的使用已表明，可以逆转由TNF介导的促炎作用，如诱导促炎细胞因子表达(IL-1、IL-8)的表达和组织破坏。此外，重组TNFR-Fc融合蛋白如ENBREL(Etanercept,Immunex)的使用已表明，TNF的拮抗作用可用于治疗TNF相关病症，特别是风湿性关节炎。

因此，已经证明，使用肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白Fc结构域融合蛋白或抗TNF中和单克隆抗体抑制TNF是治疗包括风湿病关节炎和银屑病性关节炎的各种人炎性疾病的成功治疗途径。

伴侣动物如狗会发生类似于人所发生的炎性疾病，例如风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎、血浆-淋巴细胞性滑膜炎、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎和各种自身免疫性皮肤病。据估计，在美国五分之一的成年狗有关节炎，并且狗被用作人关节疾病如骨关节炎、前交叉韧带撕裂和半月板损伤的模型。

已有大量的文献证明TNF在狗发生炎症中的作用。例如，已观察到，在患有膝关节炎的狗的滑液的细胞渗透物中，TNF-α的分泌增加，并且已显示，在患有青光眼的狗的中心视网膜和外围视网膜中，作为广泛的炎性反应的一部分，II型TNF受体显著增加。在人的心脏病的封闭胸腔模型中由球囊闭塞引起缺血再灌注后，用人TNFR-Fc融合蛋白依那西普((huTNFR-Fc)Immunex,一种TNF拮抗剂)处理狗，使心肌损伤降低约25-40％，同时伴随有相关炎症标记物如ICΑM-1和NF-kB的减少。同样，也已经证明，在缺血-再灌注的开胸狗模型中使用2mg/kg TNFR-Fc，梗死面积降低60％。然而，由于当注射于狗时人的蛋白的免疫原性，使用huTNFR-Fc作为治疗狗的疾病的治疗剂并不表明超出这个人类疾病的模型。此外，依那西普的IgG Fc结构域是补体募集的(complement recruiting)，并因此由于介导的免疫反应，其在炎性疾病的背景下是不期望的。

抗犬TNF单克隆抗体已用于通过捕获ELISA法检测用脂多糖(LPS)处理的犬PBMC的上清液中低水平的TNF，并且还报道过，在犬血管外皮细胞瘤、成视网膜细胞瘤(tricoblastoma)、脂肪瘤和肥大细胞瘤的皮肤样品中存在TNF-α表达。在骨关节炎的诱导模型中，犬关节软骨中存在TNF-α受体和TNF受体，同时已经在患剥脱性皮肤型红斑狼疮(ECLE)的两只狗中测试了抗TNF的人源化单克隆抗体阿达木单抗(Adalimumab)(每两周0.5mg/kg，共8周)，但是疾病进展照旧且血清TNF-α水平保持不变。对阿达木单抗的免疫原性会潜在地导致这些重复给药研究失去效果。具体而言，可能产生抗阿达木单抗的中和抗体会妨碍重复给药，并因此限制这种治疗途径的长期有效性。

由于TNF参与犬的各种炎性介导的病症，因此为了治疗狗的TNF相关病症和炎性病症，需要可用于长期抑制TNF的犬TNF抑制剂。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供了嵌合融合多肽，其包含、组成或基本组成为：犬TNF受体多肽的细胞外结构域或其TNF结合片段，其结合包含、组成为或基本组成为犬IgG免疫球蛋白重链的Fc区或其片段的多肽，其中所述Fc区的片段至少包含CH2和CH3恒定结构域。

通常，嵌合融合多肽特异性结合犬TNF。通常，嵌合融合多肽中和犬TNF的生物活性。在某些实施方案中，TNF是指TNF-α和/或TNF-β。嵌合融合蛋白显示提高的稳定性和体内半寿期。此外，更具体地，嵌合融合多肽在施用至犬时，通过限制中和抗体、特别是其异种抗体的生成，克服了与将迄今为止已知的抗TNF化合物施用于犬相关的问题。