[实用新型]一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属于生物技术领域，具体涉及一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。

背景技术

受体相互作用蛋白家族(receptor-interacting proteins，RIPs)是蛋白激酶家族的一个重要分支，其功能上具有特异的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶活性，属于Ser/Thr蛋白激酶家族。目前用于蛋白激酶活性检测的方法主要包括以下几类：

1.基于抗原抗体原理的ELISA方法，通过用蛋白激酶底物包被多孔板板底，加入激酶及反应液反应后，分别用针对磷酸化底物的抗体（一抗）以及针对一抗的抗体（二抗）进行孵育，通过化学发光等方式检测激酶催化底物磷酸化的程度，从而评价其活性并用于抑制剂筛选。但受蛋白纯化程度以及底物自身磷酸化影响，无法排除非特异性磷酸化的干扰，影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性。此外该方法价格昂贵、耗时长、操作步骤多，制约了化合物的高通量筛选。

2.放射性同位素标记法，蛋白激酶可催化P³²标记的ATP反应从而将P³²基团转移到底物对其进行标记，通过放射自显影检测底物被P³²标记的程度评价酶活及抑制剂对酶促反应的抑制程度。该方法特异性程度高，但缺点显著，包括对研究场所有严格限制，易造成环境污染，对研究者健康有潜在危害，且难以实现抑制剂的高通量筛选。

该方法是目前用于RIP3（受体相互作用蛋白-3）酶活检测及抑制剂筛选的唯一方法。具体方法为从Jurkat细胞裂解液中用免疫沉淀法得到RIP3蛋白，在反应液中和10μCi[³²P]γ-ATP和5μg MBP在30℃孵育30分钟，随后进行放射自显影。反应液成分为：20mM HEPES[pH7.5]，2mM DTT，1mM NaF，1mM Na₃VO₄，20mMβ-glycerophosphate，20mM MgCl₂，20mMMnCl₂，1mM EDTA，300μM ATP。

3.ATP消耗法，该方法主要包括两步反应，第一步反应是RIP3利用体系中的ATP将其底物磷酸化，将ATP转化为ADP；第二步反应是试剂盒中的荧光素酶在存在O₂和Mg²⁺的情况下利用体系中酶促反应之后剩余的ATP将甲壳虫荧光素氧化并将ATP转化为AMP同时发出荧光。该检测方法的作用原理为：将一定量的酶与底物置于反应缓冲液中，通过加入ATP启动酶促反应发生，待反应结束后，终止反应并用荧光素酶催化体系中剩余的ATP与荧光素反应从而释放荧光。在一定范围内酶促反应后ATP剩余量与荧光强度成线性正相关，而RIP3催化的酶促反应程度又与ATP剩余量成线性负相关。若荧光强度高，表明体系中剩余的ATP较多，即表明酶促反应消耗掉的ATP较少，酶促反应程度较弱。反之，若荧光强度低，表明体系中剩余的ATP较少，即表明酶促反应消耗ATP多，酶促反应程度较强。因而荧光强度与酶促反应成线性负相关，可通过检测荧光强度来评价酶促反应的程度。但由于蛋白纯化过程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性和精确性。

ATP消耗法被用于多种激酶检测，但目前针对RIP3蛋白(受体相互作用蛋白-3)仍有以下问题未解决：1.RIP3蛋白属于RIP蛋白家族，为丝苏氨酸激酶，与其它家族丝苏氨酸激酶相比，一级结构具有显著差异，并且目前晶体结构未知。除放射性同位素法外，至今尚无其它酶活检测方法报道；2.ATP消耗法方法本身存在一定局限性，如蛋白纯化过程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，此外包括底物浓度、ATP浓度、反应温度、反应时间等因素，均会影响目标蛋白酶活，因而无法直接用于抑制剂筛选；3.目前尚未发现针对RIP3的抑制剂，无阳性化合物能被用来对该体系进行校正优化以满足抑制剂检出度的要求和反应高信噪比的要求。

实用新型内容

因此，本实用新型要解决的技术问题是针对目前RIP3蛋白激酶抑制剂筛选方法较为局限的问题，提供了一种特异性高，使用方法简便的筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。

本实用新型是通过下述技术方案来解决上述技术问题：