[发明专利]一种O型口蹄疫CTL表位肽及筛选方法

说明书

技术领域

 本发明属于分子免疫学领域，具体涉及SLA-Ⅰ结合并能够引起细胞毒性免疫应答的O型口蹄疫CTL表位肽以及利用SLA-I复合体筛选和鉴定所述CTL表位肽的方法。 

背景技术

猪主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)，亦即猪的白细胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA)，是猪重要的免疫应答分子。SLA共分为三类，分别为SLA-I、SLA-II、SLA-III。其中SLA-I类分子包括重链和轻链，重链具有多态性，功能基因主要为SLA-1, -2, -3。而轻链由Beta 2微球蛋白(Beta 2 microglobulin, β2m)基因编码。在细胞内质网，SLA-I重链、抗原多肽与轻链以非共价键结合，形成SLA-I-peptides复合物，经高尔基体加工后，递呈到细胞表面，与CD8+ T淋巴细胞受体结合，引起细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)免疫应答，CTL释放细胞因子并杀死被病毒感染的靶细胞。能够与SLA-I类分子结合并能引起细胞毒性免疫应答的多肽即为CTL表位。 

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是危害偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病的病原，血清型分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型，各型之间无交互免疫力。由于口蹄疫病毒的流行株不断变异，传统的疫苗已经不能适应口蹄疫防治的要求。含有多种血清型和不同流行株的表位疫苗可以起到防治不同血清型口蹄疫病毒的要求。研制口蹄疫病毒表位疫苗的关键是确定表位，细胞表位包括B细胞表位、辅助性T细胞(T helper, Th)表位和CTL表位。目前，多个B细胞表位和Th表位已经报道。口蹄疫属于严格的细胞内寄生物，体液免疫固然重要，但细胞免疫必不可少。近来的研究表明，在FMDV急性发作期的控制主要是由中和抗体发挥作用，而在FMDV持续性感染期的免疫方面则主要由CTL 发挥作用。最近，一些学者开始研究口蹄疫病毒的CTL表位。2006年，Barfoed（Antiviral Res, 2006, 72(3):178-89）等证实了一个小鼠H-2Kd限制性的来源于口蹄疫病毒非结构蛋白2C的CTL表位 KYKEAKEWL，能够在小鼠体内引起CTL反应。另外，Guzman等（J Gen Virol, 2008, 89(Pt 3):667-75）最近也证实了一个牛BoLA N*02201限制性的口蹄疫病毒CTL表位，该表位位于O型口蹄疫UKG/2001株结构蛋白的795- 803 氨基酸残基，该表位能够引起靶细胞杀伤效应。然而，到目前为止，所有报道的口蹄疫病毒CTL表位都是通过小鼠、牛等动物加以验证，至今还未报道经猪SLA-I类分子直接递呈的口蹄疫病毒CTL表位。 

研究表明，利用体外构建MHC I重链分子、肽及轻链复合体的方法可以在体外筛选病毒表位。White等（J Immunol, 1999, 162(5):2671-6）用一个Linker将小鼠MHC-I的重链和轻链连接，构建了MHC-I分子，并证明了它可以和抗原肽分子特异结合。Denberg等（Eur J Immunol, 2000, 30(12):3522-32）用一个多肽、Linker、重链及轻链β2m构建了人的HLA-A2单链分子，并证明构建的结合多肽的单链分子具有识别细胞受体的功能。在课题组前期研究中，已经构建了六品系猪SLA-I复合体蛋白，并且在pMAL-p2X进行了表达，经检测表达蛋白为可溶性蛋白，并保持良好的蛋白构象。本发明在前期研究的基础上，利用构建的六品系猪SLA-I单链分子在体外结合口蹄疫病毒的CTL模拟表位肽，质谱测定筛选能够与复合体结合的多肽。可结合的多肽经过ELISPOT实验检测多肽的CTL活性。本发明为今后大量筛选口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并为研制猪口蹄疫病毒多表位疫苗奠定基础。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够与SLA-Ⅰ分子结合并能够引起细胞毒性免疫应答的O型口蹄疫CTL表位肽。 

    为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为一种O型口蹄疫CTL表位肽，所述O型口蹄疫CTL表位肽命名为 Q01，其由九个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为：Ala-Thr-Arg-Val-Thr-Glu-Leu- Leu-Tyr（SEQ ID No:1），即丙氨酸-苏氨酸-精氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸。