[发明专利]一种具备空间光调制照明的共聚焦显微成像方法

说明书

技术领域

本发明技术领域是光学显微成像技术，更具体的是实现共轭成像原理的共轭光学显微成像技术领域，提供一种具备空间光调制照明的共聚焦显微成像方法。

背景技术

共聚焦显微成像技术就是在照明光路中实现照明针孔、在成像光路中实现探测针孔的显微成像技术。根据实现共轭聚焦的装置和方式，共聚焦显微成像技术大体上可分为三类。第一类是激光扫描共聚焦显微成像技术LSCM（Laser Scanning Confocal Microscopy），是通过动态控制振镜将投射其上的激光斑点对样品实现逐行扫描，多行扫描完成样品整个观察视场FOV的扫描。激光扫描共聚焦显微成像技术（LSCM）是产业化得最早的共聚焦显微成像技术。这类方法图像质量与信噪比高，然而时间效率低，一般在一秒钟一幅共轭图像。另外该技术难于在图像质量与图像速度这一始终矛盾的技术指标中根据用户当时需要快速调节。

第二类是碟片共聚焦显微成像技术SDCM（Spinning-disk Confocal Microscopy）。该类技术利用高速旋转刻有多条螺旋排列的孔动碟片实现样品孤立点照明、孤立点探测（及共轭成像原理），获得共聚焦图像。该类方法提高了共聚焦显微成像技术的时间效率，一般能够在一秒钟获得几幅甚至几十幅的共聚焦图像。另外该技术在照明光路中添加微阵列聚光镜，提高照明光源的使用效率。碟片共聚焦显微成像技术采用旋转多针孔碟片以及与之匹配的微型聚光镜实现多光束扫描的方法，克服了LSCM效率低，成像速度过慢等缺点，实现并行共聚焦显微成像，可以实时成像。这类方法难度很高，因而造价昂贵。另外与SLCM一样，该类技术也不能快速调节图像质量与成像速度来满足用户实际观察需要。

第三类技术是利用结构光实现照明针孔，获得显微镜SIM（StructuredIllumination Microscopy）。结构光显微镜SIM是在落射显微镜基础上增加照明调制功能，通过采集多幅互补图像并经过计算机合成方法来提高图像在纵向和横向的分辨率。第三类技术提高成像效率，同时降低造价。中国发明专利申请200810071654.8提供了一种二维空间光调制技术，来提高含有二维空间光调制器的显微成像系统的空间分辨率。然而所述发明中照明空间调制模式之间必须有较大重叠量：一维调制模式重叠量为50%，因此时间效率降低1/2；二维照明空间调制模式重叠量为，时间效率降低55%。另外，该方法实现非常有限的调制模式，不能在较大范围内动态调节成像速度与成像质量。

因此在共聚焦显微成像领域，还有待发明既能提高图像成像质量，又能根据需要提高成像速度的方法，来满足用户在观察过程中，有时需要高的成像速度来做初步快速观察或者对活细胞做跟踪观察，有时需要提高图像质量如横向分辨率、纵向切片分辨率、图像对比度、图像清晰度等要求来提供高质量图片用于发表。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高共聚焦显微成像系统速度、图像分辨率和信噪比等图像质量，并使得在追求成像速度与成像质量这一对相互冲突的指标过程中用户根据需要动态快速大范围内调整的具备空间光调制照明的共聚焦显微成像方法。

本发明的技术方案如下：

一种具备空间光调制照明的共聚焦显微成像方法，步骤如下：

1）将一个样品观察视场分割成N个空间互补的平面照明图案P_i，其中，N≧1，i=1，2，…，N；

2）生成对应于P_i的二维空间光调制器的微阵列矩阵D_i，并控制二维空间光调制器产生对应于P_i的空间调制照明模式；

3）图像探测器曝光并获取在当前照明调制模式下的样品图像I_i，并将样品图像I_i提供给计算控制单元，在图像探测器完成样品在P_i的空间调制照明模式下的曝光后，计算控制单元通知二维空间光调制器消除当前的照明调制模式，等待P_i+1的空间调制照明模式；

4）计算控制单元根据预先刻度好的二维空间光调制器与图像探测器的空间对应关系R，首先计算出二维空间光调制器产微阵列模式D_i所对应的图像探测器成像面上虚拟针孔位置模式V_i；

5）根据虚拟针孔位置模式V_i对样品图像I_i进行虚拟针孔运算操作，获取一幅对应于在当前空间调制照明模式下实现了虚拟针孔的改进的样品图像Fi；