[发明专利]一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。

背景技术

人胰岛细胞移植是治疗糖尿病的有效方法，但人源供体的短缺使人们越来越多的将目光投向寻找人胰岛替代品上，猪胰岛素同人胰岛素十分类似，并且有相近的血糖调定点，十分适合作为人体胰岛替代品，成体猪胰岛十分脆弱容易离散，新生猪胰岛具有免疫源性低，β细胞分裂潜能等特性，成熟后具有良好血糖刺激反应（Korbutt,G.S.;Elliott,J.F.;Ao,Z.;Smith,D.K.;War-nock,G.L.;Rajotte,R.V.Large scale isolation,growth,and function of porcine neonatal islet cells.J.Clin.Invest.97(9):2119–2129;1996），经过一段时间的体外培养过程有助于纯化胰岛细胞并使β细胞发育成熟，从生理生化特性上来说相对于成体猪胰岛更适合作为人胰岛的替代品。

而胰岛细胞体外培养技术早在二十世纪60年代就由Lacy（Lacy PE,Kost ianovs ky M.Meth od for the isolat ion of int act islet s of langerhans from the rat pancreas.Diabet es,1967,16:35～39）等人提出，经过不断改进，培养方法已逐步趋向完善，胰岛细胞的培养是为了在体外获取纯化有活力的性能成熟胰岛细胞，而胰岛细胞不能形成单层细胞，而是作为细胞团（cluster）而存在，从而为培养增加了难度。

现今新生猪胰岛细胞培养操作方法，一般采用1-5天的新生猪，解剖取胰腺，破碎后用胶原酶消化成细胞团，置于CMRL1066,RPMI等细胞培养基内培养3-5天，维持其生长或诱导其定向分化。但这些方法以及使用的培养基总是存在着很多缺陷，如：培养结果不稳定，纯化获得的有活性功能胰岛细胞的量各不相同（2000IEQ/g-4000IEQ/g），培养胰岛细胞的纯度也各有差别（70-90%）；在低温培养过程中胰岛细胞会因细胞凋亡而产生丢失，尤其是β细胞，而且培养过程长短难于选择，培养时间短则β细胞不能发育成熟，培养时间过长则会有大量胰岛细胞因凋亡产生丢失，一般回收率只有60%左右，且由于β细胞凋亡使得同等量胰岛细胞胰岛素分泌量减少（insulin/DNA值为<49.00mIU/g）。此外，随着培养时间延长，胰岛细胞团易破碎，进而形成的小胰岛细胞团（直径<50um）更易于死亡，难于培养，而且使培养过程难于清除污染，易于给后续的移植过程带来炎症反应，对后期移植的治疗效果十分不利。至今没有能大量提供高纯度有活性并且稳定产量的胰岛细胞培养方法以及培养基，所以如何通过建立优化最佳细胞分离方案、培养基成分以及培养方式成为胰岛细胞培养最迫切的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种改良的能经过培养提供有高活性，高存活度，包膜更完整，细胞团大小合适并且有稳定产量的针对新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。

本发明的改良的新生猪胰岛细胞培养基，是在HAM’S F10培养基中添加细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK20μΜ、人碱性成纤维细胞生长因子hFGF-β10-20μg/L，血管内皮生长因子VEGF10-20μg/L，胰岛素样生长因子R3-IGF-110-20μg/L，人表皮生长因子hEGF10-20μg/L，肝细胞生长因子hHGF10-20μg/L以及占培养基体积百分比10%的猪血清，还有亚硒酸钠6.7ng/L，胰岛素10μg/L，转铁蛋白5.5μg/L，乙醇胺2μg/L，1-甲基3-异丁基黄嘌呤0.011g/L，烟碱1.22g/L,皮质醇5μM，80U/ml青霉素、100U/ml链霉素。

所述的改良的新生猪胰岛细胞培养基的使用方法，新生猪胰岛细胞在培养基中的接种浓度为5000-10000IEQ/25-30ml，在37℃、5%CO₂、95%空气培养箱内培养，制备的细胞在第一天更换培养皿及培养基，此后每隔一天更换一次，培养6-10天。

本发明选用的各种原料作用如下：

1、细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK，分子式为Z-Val-Ala-Asp-CH₂F，即C₂₁H₂₈FN₃O₇，分子量

为453.5，纯度>95%，具有抑制细胞凋亡的作用。