[发明专利]用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒，以及该病毒的构建方法，以及该病毒所表达的融合蛋白的纯化方法。 

背景技术

疟疾是一种由疟原虫造成的，通过以按蚊为主要媒介传播的全球性急性寄生虫传染病。据世界卫生组织统计，全球大约有3.2亿人口生活在疟疾流行的地区，每年夺去大约100万人的性命并导致4亿人感染，每年感染疟疾致死的人群中，92%为五岁以下的儿童，而每年各国用于疟疾预防和治疗的资金也达到了10亿美元。由于疫区感染人口的流动性和疟原虫抗药性的出现使得传统的药物治疗疟疾方法面临更加严峻的挑战。因而一种全新的疟疾疫苗的研制势在必行，并已成为疟疾防治中的重要内容。 

在已知的很多种疟疾候选疫苗中，传播阻断疫苗的前景是很好的，其中间日疟传播阻断候选抗原中Pvs25在疟疾的传播过程中发挥重要作用，对Pvs25的研究也是很广泛。现在的生物技术常用的生物体是各种种类的酵母菌核大肠杆菌，但是通过大肠杆菌表达出来的Pvs25蛋白在传播阻断实验中并没有检测到有明显的免疫原性和免疫保护性，而用酵母其中的毕赤酵母表达的Pvs25蛋白可以有很好的表达，得到的抗体也可以检测到免疫原性和保护性，而且已经进入了临床I期，但是在进入下一期临床的时候，人体产生了排斥反应。现如今表达的哺乳动物表达系统可以看到效果，但是表达量很低，成本相对较高，不满足大量生产需要。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒，该病毒在家蚕BmN细胞中传代培养细胞获得F3代病毒，以此F3代病毒接种家蚕五龄幼虫，检测重组杆状病毒Pvs25在家蚕五龄幼虫中的高效表达。此种方法相比较原核的和其他的真核表达系统表达蛋白的方法具有表达量高、安全性好、生产成本低、易于大规模生产操作的特点。 

本发明所采用的技术方案为： 

一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，它由间日 疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到pFastBacHTB载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒。 

具体地，所述Pvs25基因具体插入到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间。 

具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 

本发明进一步提供用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25的构建方法，包括以下步骤： 

（1）通过PCR扩增的方法得到间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因，然后将Pvs25基因连接到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacHTB-Pvs25； 

（2）将重组转座质粒pFastBacHTB-Pvs25转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，白斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定； 

（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25。 

本发明还进一步提供上述重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤： 

（1）选用Ni亲和层析柱，Bindingbuffer平衡后将收集的含目的蛋白的液体上样，室温孵育15min； 

（2）收集穿透液，用10倍柱体积的Bindingbuffer平衡柱子，并收集流出液； 

（3）分别用5倍柱体积的20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑洗柱子，并收集对应的流出液，然后将每一个咪唑梯度的样品用10KD的超滤膜浓缩至1mL； 

（4）将每一个收集的样品进行制样，然后SDS-PAGE和Westernblotting鉴定。鉴定结果表明，间日疟传播阻断候选抗原Pvs25融合蛋白在重组杆状病毒BmPvs25内高效表达。