[发明专利]重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业规模化生产的重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法。 

背景技术

红鳍东方鲀（Fugu rubripes）在我国主要分布于黄海、渤海和东海，是近海底层肉食性鱼类，其肉味鲜美，具有很高的食用价值，在红鳍东方鲀的生殖腺和肝脏等内脏中产生河豚毒素，其高活性和高特异性的生物特征具有潜在的医药开发价值，在临床上具有广阔的前景。抗菌肽是一类具有杀菌抑菌功能的小分子多肽，红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1对革兰氏阴性菌和阳性菌都有较好的抑菌杀菌功效，同时还会增强鱼体的免疫反应；而其本身又是一种鱼源多肽，不会残留，不会引发生态问题。然而，从红鳍东方鲀中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产。 

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业规模化生产的重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法。 

本发明的技术解决方案是：一种重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法，其特征按如下步骤进行： 

a. 以pET32a+载体为模板，用引物pETF19/pETR19进行PCR扩增；所述引物pETF19/pETR19序列如下：

pETF19：5’-GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’；pETR19：5’-TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3’；

b. 以a步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物76F20/pETR19进行PCR；所述引物76F20序列如下：

5’-AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’；

c. 以b步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物50F21/pETR19进行PCR扩增；所述引物50F21序列如下：

5’-TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’；

d. 以c步骤反应产物的20倍稀释液为模版，用引物25F21/pETR19进行PCR扩增，所述引物25F21序列如下：

5’-ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’；

e. 以d步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物NcoIF/XhoIR进行PCR扩增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下：

上游引物NcoIF：5’-CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’；

下游引物XhoIR：5’-CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’；

f. 电泳回收e步骤PCR产物与克隆载体pMD19T连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，再涂布于含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB固体平板上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择120bp 大小的条带进行回收；

g．用限制性内切酶NcoI和XhoI分别双酶切f步骤所回收产物的质粒和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并筛选提取重组表达质粒；

h．将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株TransB(DE3)大肠杆菌感受态细胞内，挑取单克隆经IPTG诱导后收集菌体；

i. 将收集的菌体用pH8.0、0.5M Tris-HCl缓冲溶液重悬，进行超声波破碎，离心取上清，过Ni-TNA柱纯化，收集洗脱液；

j. 将洗脱液透析，获得重组表达蛋白。

    所述a步骤的PCR反应条件为：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，56℃复性30s、72℃延伸20s，循环30次，72℃延伸7min，4℃保存； 

所述b步骤的PCR反应条件为：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，58℃复性30s、72℃延伸20s，循环30次，72℃延伸7min，4℃保存；

所述c步骤的PCR反应条件为：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，59℃复性30s、72℃延伸20s，循环30次，72℃延伸7min，4℃保存；