[发明专利]一种从鱼鳞胶原蛋白肽中分离功能多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种以鱼鳞胶原蛋白肽为原料分离功能多肽的方法。

背景技术

胶原蛋白是动物细胞合成的一种天然生物高分子，作为细胞外基质中的重要成分几乎存在于所有组织内，约占动物总蛋白的30%，胶原蛋白具高度抗延伸能力，使得皮肤等结缔组织得以维持一定的结构并具有特殊的机械力学性质以实现支撑和保护细胞、组织和机体功能，对细胞和组织的结构与性能等方面十分关键。胶原蛋白肽是以胶原为原料采用热处理、酸/碱处理、酶法降解或结合多种方式降解获得的多肽混合物，其主要成份是胶原降解后形成的分子量不均一的多肽。

鱼胶原蛋白肽是一种功能食品或保健品原料，许多研究表明鱼胶原蛋白肽中存在大量的生物活性组分，包括具有抗氧化、抑制ACE活性、抗溃疡、抑制关节炎、提高免疫力、增强骨密度以及预防骨质疏松等生物活性的多肽。胶原蛋白肽的生物活性与其组成多样性密切相关，从鱼胶原蛋白中有效识别并分离出具有生物活性的多肽组份是近年来鱼鳞胶原蛋白肽研发的热点和难点。

传统的鱼鳞胶原蛋白产品研发的重点主要集中于鱼鳞胶原蛋白制备工艺对产品整体生物活性的影响以及对产品分子量范围的影响等。韩国Hee-Guk Byun利用离子交换色谱和凝胶过滤色谱的方法从胶原蛋白中分离出具有抑制血管紧张素转化酶活性的多肽（Process Biochemistry, 2001, 36: 1155-1162）；日本Maruyama等从胶原蛋白中分离出可抑制血小板活性的多肽（Biochimica et Biophysica Acta, 1993, 1164：215-223）；韩国Kim等人采用凝胶过滤色谱结合离子交换和反相色谱的方法从鱼皮明胶中分离出具有抗氧化功能的组份（Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(4): 1984-9）。传统的鱼胶原蛋白中不同多肽的分离方法主要基于分子量范围、带电荷状态等性质进行分离，获得的多肽特征性不强。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用亲和层析的方法从鱼鳞胶原蛋白肽中分离可与亲和层析的配基进行特异性结合的多肽。本发明涉及一种从鱼鳞胶原蛋白肽中分离功能多肽的方法具有分辨率高和分离特征性强等优点。

本发明的详细内容如下：

（1） 将鱼鳞胶原蛋白肽溶于水制成的水溶液，浓度控制在1~10mg/ml，溶液pH控制在6.5-8.0。

（2）将鱼鳞胶原蛋白肽溶液上样至亲和层析柱，上样量控制在层析柱体积的10%到16%。

（3）使用淋洗液将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出。

（4）使用洗脱溶液将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，获得洗脱液，洗脱过程的温度可控制在4℃－25℃。

（5）将洗脱液进行浓缩至固含量为10%~25%。

（6）将浓缩液冷冻干燥，所得白色粉末即为鱼鳞胶原蛋白肽中分离出的功能多肽。

本发明一种从鱼鳞胶原蛋白肽中分离功能多肽的方法中，如果待分离的胶原蛋白原料是水溶液，则省去（1）所述的胶原蛋白溶解过程，直接将胶原蛋白溶液的pH值调制6.5-8.0。

优选地，所述方法中层析介质的配基是一种多肽，其氨基酸序列可以是一种多肽，其氨基酸序列为DECEDSETRTFYQIGDSWEKYLQGVRYQCYCYGRGIGEWACEPL或包含该序列的多肽。

优选地，所述方法中使用的淋洗液可以是乙酸-乙酸钠缓冲液，也可以是碳酸钠缓冲液。

优选地，所述方法中使用的淋洗液可以是浓度时5-50%（v/v）乙醇或甲醇的水溶液。

优选地，所述方法中洗液液的浓缩方法可以是凝胶过滤层析法、膜超滤法或减压浓缩法。

如果采用5－50％（v/v）的乙醇水溶液作为洗脱剂，则省去步骤（5）所述浓缩过程，洗脱液直接进行冷冻干燥。

具体实施方式：

实施例1 

原料：鱼鳞胶原蛋白肽粉末。

（1）    将原料鱼鳞胶原蛋白肽配成水溶液，pH控制在7.0，浓度控制在3mg/ml。

（2）    将鱼鳞胶原蛋白肽水溶液上样至亲和层析柱（体积为50L），亲和层析介质的配基是多肽DECEDSETRTFYQIGDSWEKYLQGVRYQCYCYGRGIGEWACEPL；上样量为5L；亲和层析介质的粒径：80－180微米，层析柱温度控制在10℃。