[发明专利]一种活性多肽的分离提取工艺

说明书

技术领域：

本发明属于天然产物分离提取技术领域，涉及一种从毛蚶中提取小分子活性肽的方法，用柱层析技术从毛蚶中分离纯化活性肽。

背景技术：

毛蚶（Arca subcrenata Lischke;Scapharca subcrenata）属于软体动物门，瓣鳃纲，列齿目，蚶科，是我国丰富的海产生物之一，药用历史悠久。其贝壳名瓦楞子，历代本草均有记载，有化痰、软坚、制酸止痛功效；蚶肉为软体部分，多载于食疗类本草，有补血、温中、健胃等功效。毛蚶整体入药，兼具壳肉之功，能补血温中，健脾和胃，适用于血虚脾弱之症。药理实验证明毛蚶提取物对小鼠失血性贫血，溶血性贫血和骨髓功能障碍性贫血模型有良好的治疗效果。毛蚶肉中富含蛋白质、脂肪、碳水化合物，并含核黄素、尼克酸、维生素E以及多种微量元素，还含有肝糖，富含多种氨基酸，有很好的药用价值。因此，合理利用海洋资源，开发毛蚶为医药保健品具有重要意义。

从检索的文献看，在国外从毛蚶中提取活性物质的研究较少，几乎未见报道。国内有相关的文献报道了毛蚶中活性物质的提取及其活性研究。如专利文献“一种能抗癌的海洋生物提取物”（CN1248442A）就报道了从毛蚶中提取抗癌药物的研究。专利文献“毛蚶中的多肽蛋白类活性物质及其制备方法和用途”（CN1600792A）也报道了毛蚶中多肽蛋白类活性物质的制备方法和用途。上述专利文献都详细描述了毛蚶中活性物质的提取过程和药理活性的研究，但是对其中活性物质更深入的研究，如结构解析，理化性质的研究并未做报道。

发明内容：

本发明的目的在于借助于现代分离提取技术，从天然海洋产物中提取有效成份，特别是提供一种来源于毛蚶中的小分子肽类物质，包括制备方法和生物活性的研究及其活性物质的进一步分离纯化和结构解析等。

为了实现上述发明目的，本发明的提取步骤如下：

将毛蚶剥壳、清洗、匀浆、加入蒸馏水低温提取、絮凝、离心去渣，取上清液，将上清液冻干后，用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析，分别收集各峰，再用阴离子葡聚糖凝胶DEAE-SephadexA25进行离子交换柱层析实现分离纯化，收集有活性的峰，冻干后，用凝胶柱脱盐，得到纯度较高的系列天然小分子活性多肽，将得到的小分子多肽继续用C18反相柱纯化，得到纯度为95%以上的小分子活性肽，并对其结构进行解析。

该小分子活性肽是天然提取的物质，属于分子量较小的寡肽，通过本发明的制备方法得到的毛蚶小分子肽类的分子量在500～3000Da，提取过程对其生物活性进行了有效的保护。该活性肽具有显著的抑瘤活性，体外抗肿瘤实验表明抑瘤率达到52%。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

将毛蚶剥壳，取毛蚶肉，用4℃水清洗后，匀浆，按照1：1的重量比例加入蒸馏水低温（4℃）提取2小时后，絮凝，离心去渣，取上清液，将上清液冻干后，用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析（0.03mol/1NH₄HCO₃缓冲液洗脱），分别收集各峰后，取有生物活性的峰再用阴离子葡聚糖凝胶DEAE-Sephadex A25离子交换柱层析（PH8.5Tris-HC1缓冲液，0～0.03mol/NaCl梯度洗脱），收集有活性的峰，冻干后，用葡聚糖凝胶Sephadex G15凝胶柱脱盐，得到纯度较高的天然小分子活性多肽。该活性肽是天然提取的物质，未经过任何化学修饰，提取过程对其生物活性进行了有效的保护。

最后得到的提取物用动物实验（海洋生物提取物对S180小鼠的抑瘤作用）对其活性进行研究。实验方法如下：取雄性昆明种小鼠，体重19-21g，随机分组，每组10只。每只小鼠左腋下接种0.2mlS₁₈₀艾氏腹水癌的瘤液。次日开始以生理盐水为阴性对照，5-氟尿嘧啶为阳性对照进行腹腔注射，注射8天后称重，解剖皮下瘤块，称重。药物对实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算公式如下：瘤重抑制百分率（%）=（1-T/C）×100%，T：治疗组平均瘤重，C：阴性对照组平均瘤重。

表1药物对小鼠S180实体瘤生长的影响

体外抗肿瘤实验的结果表明，本方法提取得到的天然活性肽的肿瘤抑制率较高，因此，本发明提取的天然活性多肽具有抗肿瘤活性，有可能成为一种新型的抗肿瘤药物。

样品1和样品2进一步用高效液相RP-HPLC（反相高效液相）的方法精制，得到纯度大于95%的纯品，用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析/离子化—飞行时间质谱）技术确定分子量范围在500～3000Da，用ESI-MS（电喷雾离子化质谱）及MS/MS（串联质谱）等技术和手段确定了部分活性肽的氨基酸组成、结构和序列。