[发明专利]一种提高茯苓菌丝体蛋白含量和液体发酵生物量的方法

说明书

技术领域

本发明属生产技术生物制药领域，主要是一种提高茯苓菌丝体蛋白含量和液体发酵生物量的方法。

背景技术

茯苓属药用真菌，是我国传统的名贵中药材和历史悠久的食品。味甘、淡、平，具有利水渗湿、健脾补中、宁心安神等功效，并具有抗菌、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等作用。茯苓菌丝体蛋白含量影响其生长速度，提高茯苓菌丝体蛋白含量能促进菌丝生长速度，而液体深层发酵技术是获得茯苓主要药理活性物质的重要途径，但是茯苓菌丝生长速度慢，发酵后产生的生物量少，影响菌丝体中活性物质的产量，与茯苓的大量需要不相符。目前对茯苓的研究集中在茯苓多糖方面，尚未有提高茯苓菌丝体蛋白含量高和液体发酵生物量方面的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高茯苓菌丝体蛋白含量和液体发酵生物量的方法，解决目前茯苓菌丝体蛋白含量低，生长速度慢，生物量低的问题。

本发明的目的实现途径是：收集茯苓孢子，经Co60 –γ辐射诱变，进行担孢菌株配对，得到菌丝体蛋白含量高，生长快的菌株，将该菌株接种于含马尾松浸液的PDA培养基上，获得菌块，将菌块接种于马尾松浸液发酵培养基中，25℃～29℃，80～120 r/min摇床培养5～7天，获得生物量；

主要包括以下步骤：

（1）收集茯苓担孢子：用无菌生理盐水调制孢子浓度为10⁴～10⁶个/ml，经辐射剂量为300Gy～900Gy的Co60 –γ辐射诱变茯苓担孢子；

（2） 配对：将诱变茯苓担孢子悬浮液稀释10～100倍，于含马尾松浸液马铃薯培养平板中，26～28℃培养5～6天，将不同菌丝两两接在同一PDA培养平板中央，26～28℃培养4～6天，菌丝融为一体，取生长较快的组合，得到诱变菌株；

（3）将诱变的茯苓菌株接种在含马尾松浸液PDA培养基上，该培养基组成为马尾松浸液1.0%～4.0%，马铃薯水煮液15%～20%，葡萄糖0.8%～1.2%，琼脂1.5%～2.0%，25℃～29℃培养5～7天；

（4）菌丝体液体发酵培养：接种诱变菌株的菌块于马尾松浸液液体发酵培养基中，该培养基组成为马尾松浸液1.0%～4.0%，微晶纤维0.8%～3.5%，葡萄糖1.0%～3.5%，甘油0.01%～0.05%，硫酸铵0.1%～0.4%，硫酸镁0.1%～0.3%，氢氧化钾0.02%～0.06%，磷酸0.02%～0.05%，pH 5.5，25℃～29℃，80～120 r/min摇床培养5～7天；

（5）分离生物量：发酵液8×10⁴ Pa真空抽滤10 min，无菌水洗涤2～3次收集菌体，60℃烘干至恒重；

（6）菌丝体蛋白含量测定：按照GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》中的第一法凯氏定氮法测定茯苓菌丝体中蛋白含量；

（7）菌株保藏：诱变菌株保藏于石蜡油中或砂土管中，4℃保存，每一年传代一次；

本发明采用Co60 –γ辐射诱变茯苓孢子，进行担孢菌株配对，获得了菌丝体蛋白含量高的菌株，经过通过马尾松浸液液体发酵后，解决现有技术中茯苓菌丝体蛋白含量低、生长速度慢、生物量低的问题，达到了本发明的目的：

（1）    本发明首次经过诱变获得了菌丝体蛋白含量高、生长速度快的茯苓菌株；

（2）    采用的含马尾松浸液的PDA培养基较马铃薯葡萄糖琼脂培养基更有利于茯苓菌丝体的快速生长；

（3）    采用的马尾松浸液液体发酵培养基更有利于获得较高的生物量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1：

1．菌种：茯苓（Wolfiporia cocos）菌核，购自湖南靖州茯苓市场，编号为：湘靖“28”；

2．固体培养基组成为：马尾松浸液1.0%～4.0%，马铃薯水煮液15%～20%，葡萄糖0.8～1.2%，琼脂1.5%～2.0%；

3．液体发酵培养基组成：马尾松浸液1.0%～4.0%，微晶纤维0.8%～3.5%，葡萄糖1.0%～3.5%，甘油0.01%～0.05%，硫酸铵0.1%～0.4%，硫酸镁0.1%～0.3%，氢氧化钾0.02%～0.06%，磷酸0.02%～0.05%，pH 5.5；