[发明专利]一种羧甲基赖氨酸的检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及食品中羧甲基赖氨酸的检测技术领域，确切地说是一种结合HILIC亲水作用液相色谱柱对羧甲基赖氨酸的分离、利用高效液相色谱-串联质谱技术检测食品中的羧甲基赖氨酸的方法。

背景技术

多年来，利用美拉德反应赋予食物以诱人的色泽和风味的烹调方法一直倍受推崇。然而，近几年越来越多的研究表明一些美拉德反应产物对人体有害，其中已有研究证明食源性晚期糖基化终末产物(AGEs)与人类糖尿病、尿毒症、动脉粥样硬化和衰老等疾病的发生关系密切。羧甲基赖氨酸(CML)是食品中含量较高、发现较早的一种AGEs，通常被用作食品中AGEs检出的标志性物质。国内外已有越来越多的学者致力于食品中CML检测方法的研究。

目前对于食品中的CML还没有一种公认的标准检测方法，已报道的检测方法主要有：酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FID)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS／MS)。因CML极性极强，现有的HPLC-MS／MS法多数使用C18柱结合离子对试剂进行分离，对色谱柱和质谱离子源造成损害，缩短仪器的使用寿命。鉴于现有的食品中CML检测方法存在特异性抗体选择困难、样品处理复杂、准确度不高等问题，研究开发一种操作简单、准确、快速的检测新方法对于改善现有烹调方式、控制食源性CML的摄入量、促进人类健康饮食具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于针对现有CML的检测方法所存在的不足而提供一种新的CML的检测方法。

本发明所要解决的技术问题之二在于该检测方法在食品中的应用。

作为本发明第一方面的一种CML(结构式)的检测方法，其特征是以氘代羧甲基赖氨酸(D4-CML，结构式)为内标物进行内标法定量分析。CML母离子m／z205.4主要被打碎成m／z130.2子离子碎片；D4-CML母离子m／z209.0主要被打碎成m／z87.7子离子碎片。CML的二级质谱图见图1。分别测定内标物D4-CML和CML的峰面积(或峰高)并计算出相对校正因子，再根据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值，计算待测溶液中CML含量。将CML和D4-CML混合标准溶液进样高效液相色谱的HILIC亲水作用色谱柱，以甲醇-水(均含2mM乙酸铵和0.1％甲酸溶液)为流动相，采用梯度洗脱分离后，经过串联质谱检测分析，分析时间为12min，CML和D4-CML在保留时间3.47min处都有吸收峰，如图2。

所述CML和D4-CML混合标准溶液的配制方法如下：

用一定体积比的色谱纯甲醇和超纯水混合液溶解10.00mg CML标准品，定容至100mL容量瓶中，配制成0.1mg／mL的CML母液；另外，用一定体积比的色谱纯甲醇和超纯水混合液溶解1.00mg的D4-CML标准品，定容至10mL容量瓶中，配制成0.1mg／mL的D4-CML母液。再用一定体积比的色谱纯甲醇和超纯水混合液咋为溶剂将两种母液稀释成一定浓度的混合标准溶液。

作为本发明第二方面的该检测方法在食品中的应用，其特征在于，本方法是用以检测食品中的CML含量。

该方法可用以检测食品中CML的含量，在实施时，需要对食品进行前处理，具体步骤如下：将成块状的食品剪碎后粉碎，称取一定质量(粉末状食品直接称量)，在硼酸钠缓冲溶液中经硼氢化钠还原；用三氯甲烷-甲醇混合液(体积比为2：1)去除脂肪并沉淀蛋白质；沉淀物经盐酸水解后，过MCX阳离子交换小柱萃取净化；萃取液经氮气吹扫浓缩后重新溶解在一定体积甲醇-水溶液中(体积比为4：1)，得到待洲溶液；待测液在HILIC色谱柱中以甲醇-水(均含2mM乙酸铵和0.1％甲酸)为流动相进行梯度洗脱，CML被保留并与样品基质分离。选用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式(MRM)，进行串联质谱分析。

本发明利用HILIC亲水作用色谱柱对强极性的CML进行分离，建立的HPLC-MS／MS检测法成功地应用于食品中CML的检测。新建立的检测方法具有样品处理无需衍生化，检测时间短的优势，同时具有准确度高、灵敏度好等特点。

附图说明

图1为本发明CML的二级质谱图。

图2为本发明CML和D4-CML混合标准溶液的多反应监测色谱图。

图3为本发明油条CML提取液的多反应监测色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明，但本发明并不局限于实施例。

实施例1