[发明专利]一种确定样品中汞离子浓度的方法

权利要求书

1.一种确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于，包括：

（1）将生物素化核酸分子固定化至PCR反应容器的内表面，以便获得表面固定有生物素化核酸分子的PCR反应容器；

（2）将待测样品与探针核酸分子在所述表面固定有生物素化核酸分子的PCR反应容器中，其中，在汞离子的作用下，所述探针核酸分子能够与所述生物素化核酸分子特异性结合，以便获得汞离子-核酸分子复合物；

（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未结合汞离子的核酸分子；

（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对与汞离子特异性结合的核酸分子进行实时荧光定量PCR；以及

（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的汞离子浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的3’末端被生物素修饰。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将生物素化核酸分子固定化与PCR反应容器的内表面进一步包括：

用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；

用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理；

向所述PCR反应容器中加入所述生物素化核酸分子，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述生物素化核酸分子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将生物素化核酸分子固定化与PCR反应容器的内表面进一步包括：

用20微升0.8重量%的戊二醛溶液在37摄氏度下对所述PCR反应容器进行处理5小时，并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗；

用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37摄氏度下对所述PCR反应容器处理2小时，其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5 ng/mL，并用PBST溶液进行清洗，其中，所述PBST溶液含有10mM PBS，pH 7.2，0.05重量% Tween-20；

向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为50nM的所述生物素化核酸分子，在37摄氏度下反应40分钟，并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗，其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mM NaCl，75mM C₆H₅Na₃O₇。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中汞离子浓度不低于0.03ng/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中汞离子浓度为0.05ng/mL~10 ng/mL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物组由下列引物构成：

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQ ID NO：3）

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’（SEQ ID NO：4）。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针核酸分子的浓度为200nM，并且所述探针核酸分子与所述待测样品等体积混合。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度：

y=-1.1758x+6.6826，

y为所述实时荧光定量PCR的Ct 值，x为相应的汞离子浓度。