[发明专利]一种负载骨形成蛋白的静电纺纤维的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种静电纺纤维的制备方法，尤其涉及一种负载骨形成蛋白的静电纺纤维的制备方法。

背景技术

虽然骨组织具有快速的自我修复能力，但是在一些临界尺寸的创伤中，密质骨的再生常常被纤维状或人体上皮组织的渗透所抑制。现有技术中，引导骨再生(GBR)方法可缓解这一问题，这种方法通常采用多孔膜作为软组织浸润的屏碍，同时促进密质骨的形成。

静电纺丝是一种可以制备微米至纳米尺寸的密集纤维的简单的方法，且纤维的直径可以通过优化纺丝液的浓度、环境和纺丝时间来控制。很多种材料，包括天然的和合成的，已经被用来制备静电纺纤维并且用于骨的再生。例如，聚(己内酯)(PCL)、天然纤维和壳聚糖等的静电纺纤维已被用于控制骨髓干细胞(hMSCs)和造骨细胞的分化，并已用在体内骨形成方面。然而有限的生物活性，特别是诱导和增强骨再生能力，使这些材料在引导骨再生技术的应用上远远不够理想。

骨成型蛋白质(BMPs)是强有力的诱导分子，可以刺激骨生长和干细胞到成骨细胞的分化。然而，直接将BMPs注射不能够提供有效的骨诱导效应因为其很快就会消散，为了解决这个问题，嵌有BMP的静电纺纳米纤维已经发展成为一种非常有前景的引导骨再生膜。利用共价结合力将BMPs固定到静电纺纳米纤维的表面，以在靶向组织产生连续的骨生长诱导信号。固定的蛋白质能够有效地赋予其高的浓度可控的局域化信号，因为将其固定在生物材料的表面通常需要多步骤过程，而在这个过程中蛋白质对生理环境是非常敏感的并且很容易变性失活。

源于BMP系列的较短顺序缩氨酸的应用提供了一种有效的途径可以避免蛋白质的失活。例如，源于BMP-2的缩氨酸(73-92氨基酸)已经被合成出来并且通过共价结合到藻酸盐的水凝胶上，这种材料可以增强小鼠中胫骨和腿部肌肉的骨再生。

发明内容

本发明涉及一种基于聚丙交酯共聚乙交酯(PLGA)的生物可降解的静电纺纤维并用作骨再生的导向膜，上面负载有源于骨成型蛋白质7(BMP7)的骨形成缩氨酸1(BFP1)。针对BFP1的负载，本发明提供了一种依赖于多巴胺(PD)的简单的方法：首先将PLGA静电纺纤维涂覆上多巴胺，然后在弱碱条件下用点涂的方法将BFP1固定到纤维表面。具体方法如下：

(1)PLGA静电纺纤维的制备：PLGA溶解到1，1，1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)中搅拌36～48h，形成浓度5～10wt％的纺丝液，用静电纺丝的方法制备PLGA纤维。纺丝电压为16～24kV，注射器为17～21G注射针，注射速度为3～5mL／h，接收装置为覆盖有铝箔的转筒。

(2)多巴胺(PD)的涂覆：首先用50mmol／L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.5)配置4mg／mL的3,4-二羟基苯胺溶液，将PLGA静电纺纤维浸入其中，然后在摇摆器上摇2～4h，将反应液吸出后用去离子水洗涤多巴胺涂覆的纤维三次。

(3)BFP1的负载：首先在50mmol／L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.5)中配置20μg／mL的BFP1溶液，然后将多巴胺涂覆的PLGA纤维浸入其中并在37℃下培养36h。

本发明制备的静电纺PLGA纤维表面固定的BFP1支持胶原蛋白I的紧凑分布和人体间质干细胞的扩散；多巴胺涂覆的PLGA纤维和负载有BFP1的PLGA纤维可以提高骨的生长速度。本发明涉及的材料和制备方法是一种可以构建用于引导骨再生的临床实用性的生物活性膜的非常有前景的工具。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面结合具体实例对本发明做进一步的详述：

(1)PLGA静电纺纤维的制备：PLGA溶解到1，1，1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)中搅拌36h，形成浓度5wt％的纺丝液，用静电纺丝的方法制备PLGA纤维，纺丝电压为18kV，注射器为19G注射针，注射速度为4mL／h，接收装置为覆盖有铝箔的转筒。

(2)多巴胺(PD)的涂覆：首先用50mmol／L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.5)配置4mg／mL的3,4-二羟基苯胺溶液，将PLGA静电纺纤维浸入其中，然后在摇摆器上摇3h，将反应液吸出后用去离子水洗涤多巴胺涂覆的纤维三次。

(3)BFP1的负载：首先在50mmol／L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.5)中配置20μg／mL的BFP1溶液，然后将多巴胺涂覆的PLGA纤维浸入其中并在37℃下培养36h。