[发明专利]高活力表达疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶LN的酵母工程菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株高活力表达疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶LN的酵母工程菌株，属于生物工程领域。 

（二）背景技术

脂肪酶（lipase,EC3.1.1.3），全称三酰甘油酰基水解酶，广泛存在于生物体内。脂肪酶底物是甘油酯类，水解位点是甘油和12个碳原子以上不溶性长链脂肪酸所形成的酯键，能够分解生物产生的各类天然油和脂肪。作为一种界面酶，脂肪酶的水解反应只发生在油-水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产，其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。 

疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus），它分布广泛，生长上限较高，产生的脂肪酶具有较高的工业价值。T.lanuginosus脂肪酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表达产物同样具有原始菌株T.lanuginosus脂肪酶的优良特性。 

定向进化具体应用到酯酶和脂肪酶的改造上的成功的方法和策略，以及近些年来，所取得了重要研究进展。定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得的巨大成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。 

（三）发明内容

以表达疏绵状嗜热丝孢菌（T.lanuginosus）脂肪酶LN的毕赤酵母工程菌GS-TA-LN为出发菌株，利用定向进化的方法对其进行分子改造。并通过高通量筛选方法最后筛选出一株正向突变菌株GS-TA-LN4，对此工程菌进行发酵，通过硫酸铵沉淀、 DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等步骤纯化了突变蛋白并测定酶活，结果其酶活是野生菌株所产酶活力的3.4倍。对此突变基因进行测序，并与野生基因比较得出，GS-TA-LN4中脂肪酶基因较原始的脂肪酶基因ln有4个碱基发生改变，分别是第153为由A变为G（密码子由GCA变为GCG），氨基酸未发生变化，都编码丙氨酸（Ala，A）；第287位由T变为C（密码子由GTG变为GCG），引起了氨基酸的变化，第96位氨基酸由丙氨酸（Ala,A）变为缬氨酸（Val,V）；第378位由T变为C（密码子由GCT变为GCC），氨基酸未发生变化，都编码丙氨酸（Ala，A）；第395位由G变为A（密码子由CGG变为CAG），引起了氨基酸的变化，第132位氨基酸由谷氨酰胺（Gln,Q）变为精氨酸（Arg,R）。 

（四）附图说明：

图1：易错PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 

泳道M：Marker-DL2000 

泳道1：cDNA(ORF) 

图2：平板透明圈法筛选酵母转化子 

图3：含G418的YPD平板筛选酵母转化子 

图4：GS-TA-LN4表达脂肪酶的SDS-PAGE 

泳道M：低分子量蛋白Marker 

泳道1：纯化的重组脂肪酶GS-TA-LN4 

图5：GS-TA-LN与GS-TA-LN4酶液的酶活力比较 

图6：GS-TA-LN与GS-TA-LN4脂肪酶氨基酸序列比对 

（五）具体实施方式：

实施例1：疏绵状嗜热丝孢菌（T.lanuginosus）脂肪酶LN突变体库的构建 

（1）易错PCR及条件摸索： 

采用易错PCR法对目的基因进行改造。引物为： 

上游引物LN-5’：5’-TTGCTACGTACGGCCTGTTCGACGAGC-3’（SnaBⅠ） 

下游引物LN-3’：5’-GGCCTAGGTTAATCACACTCTGAAATGGG-3’（AvrⅡ） 

易错PCR反应体系摸索：50μL体系中含1×TaqDNA聚合酶缓冲液、0.2mmo1/L dATP和dGTP，1.0mmo1/L dCTP和dTTP，10μmol/L上下游引物、4-7mmo1/LMg²⁺、0-5mmo1/L MnCl₂模板DNA从质粒扩增获得。 

PCR反应体系： 

PCR反应条件：