[发明专利]一种牡丹褐化愈伤组织恢复的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牡丹褐化愈伤组织恢复的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

牡丹为芍药科芍药属多年生落叶亚灌木，是我国传统名花，富丽堂皇、国色天香，深受世界人民的喜爱。牡丹繁殖困难，长期以来主要通过嫁接的方式进行繁殖，至今难以实现优质种苗的规模化生产。目前，牡丹组织培养技术逐渐兴起，通过诱导牡丹外植体形成愈伤组织再完成再生植株的诱导途径成为快速有效繁殖牡丹植株的捷径；然而，目前牡丹组织培养技术还不成熟，愈伤组织的诱导率不高，且形成的愈伤组织中，褐化问题比较明显。抑制褐化通常在诱导愈伤组织形成的过程中向培养基中加入活性炭等物质抑制褐化发生，对于愈伤组织诱导率比较低且褐化严重的牡丹而言，仅仅通过抑制褐化愈伤组织发生是不够的，如果能够将褐化的愈伤组织恢复成正常的愈伤组织而加以利用，无异于进一步提高了愈伤组织的诱导率和利用率。

发明内容

本发明的目的是提供一种牡丹褐化愈伤组织恢复的方法，对已经发生褐化的愈伤组织进行恢复，使其恢复到正常组织状态并可以进一步诱导再生植株的发生。

本发明是通过下述技术方案实现的：一种牡丹褐化愈伤组织恢复的方法，包括如下步骤：

（1）第一次接种：无菌环境中将褐化的牡丹愈伤组织转移MS培养基中，于20℃，500-1000Lx下培养7d；

（2）第二次接种：将步骤1中的愈伤组织进行第二次接种，于17℃，全黑暗条件下培养7d；

（3）第三次接种：将步骤2中的愈伤组织进行第三次接种，于14℃，全黑暗条件下培养7d；

（4）第四次接种：将步骤3中的愈伤组织进行第四次接种，于10℃，全黑暗条件下培养7d；

（5）第五次接种：将步骤4中的愈伤组织进行第五次接种，于15℃，全黑暗条件下培养7d。

优选的，所述步骤1-4所述的接种培养基为MS培养基，培养基中添加40g/L蔗糖和7g/L琼脂，高压灭菌冷却至室温后待用。

优选的，所述步骤5中接种培养基为MS培养基，培养基中添加维生素20 g/L蔗糖和7g/L琼脂，高压灭菌冷却至室温后待用。

本发明所述的牡丹褐化愈伤组织恢复方法，采用逐步降低温度的方法恢复褐化的愈伤组织，同时，接种培养基中的不含任何种类和浓度的激素，避免任何抗氧化剂的副作用，褐化的愈伤组织恢复显著，用恢复的愈伤组织进行再生植株的诱导，形成的再生植株与正常愈伤组织诱导的植株没有任何差别。

具体实施方式

实施例1：

将褐化的牡丹愈伤组织于无菌环境中转移MS培养基中，于20℃，500-1000Lx下培养7d；将上述愈伤组织进行第二次接种，于17℃，全黑暗条件下培养7d；将上述愈伤组织进行第三次接种，于14℃，全黑暗条件下培养7d；将上述中的愈伤组织进行第四次接种，于10℃，全黑暗条件下培养7d；将上述愈伤组织进行第五次接种，于15℃，全黑暗条件下培养7d；所述步骤1-4所述的接种培养基为MS培养基，培养基中添加40g/L蔗糖和7g/L琼脂；所述步骤5中接种培养基为MS培养基，培养基中添加20 g/L蔗糖和7g/L琼脂培养基均高压灭菌冷却至室温后待用。共接种30瓶褐化的愈伤组织，其中28瓶恢复正常，这28瓶愈伤组织与正常愈伤组织诱导的再生植株相似，形成的植株正常无畸形。

实施例2：

操作步骤与实施例1相同，共接种30瓶褐化的愈伤组织，其中27瓶恢复正常，这27瓶恢复的愈伤组织形成的再生植株，叶片比正常愈伤组织形成再生植株的叶片宽大。

实施例3：

操作步骤与实施例1相同，共接种30瓶褐化的愈伤组织，其中24瓶恢复正常，这24瓶恢复的愈伤组织形成的再生植株，株高比正常愈伤组织形成再生植株的矮1-3cm。

实施例4：

操作步骤与实施例1相同，共接种30瓶褐化的愈伤组织，其中28瓶恢复正常，这28瓶恢复的愈伤组织形成的再生植株与正常愈伤组织形成再生植株相似。

实施例5：

操作步骤与实施例1相同，共接种30瓶褐化的愈伤组织，其中26瓶恢复正常，这26瓶恢复的愈伤组织形成的再生植株的叶片比正常愈伤组织形成再生植株的叶片颜色鲜绿。

上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。