[发明专利]一种半滑舌鳎性别特异SCAR标记及应用方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎性别特异SCAR标记及其在遗传性别快速鉴定中的应用。

背景技术

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国特有的近海温水性大型底栖鱼类，分布于以黄、渤海为主的我国沿海地区。半滑舌鳎肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，具有广阔的养殖前景，是重要的名贵海水养殖鱼类。

生产实践表明，半滑舌鳎雌、雄鱼生长速度差异巨大，雌性的生长速度是雄性的2-4倍。半滑舌鳎雄鱼生长慢、个体小的特点，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，制约了半滑舌鳎养殖产业的可持续发展。因此，筛选半滑舌鳎性别特异标记，建立遗传性别鉴定的快速方法，进行半滑舌鳎性别控制，提高半滑舌鳎养殖群体的雌性比例，乃至研制出全雌苗种，是进一步推动半滑舌鳎养殖业可持续发展的有效途径。而实用有效的半滑舌鳎性别鉴定标记，则是实现这一目标的必要工具。

半滑舌鳎性别决定系统为ZZ/ZW型，即雄性为ZZ,雌性为ZW,具有异形的W染色体（周丽青等，2005）。半滑舌鳎可产生Z型精子和Z型、W型两种细胞。在自然条件下，得到正常的ZZ雄性和ZW雌性后代。通过人工雌核发育诱导，可产生ZZ雄鱼和WW超雌鱼，理论上，超雌鱼是培育全雌苗种的必要条件。因此，鉴定ZZ雄鱼、ZW雌鱼和WW超雌鱼的快速有效手段，具有重要的科学意义和应用价值。

在半滑舌鳎性别特异分子标记筛选和遗传性别鉴定方面，黄海水产研究所已经先后筛选到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记（Chen et al.，2007）和性别连锁微卫星标记（Chen et al.,2012）。但是在实际应用中，这两种标记都有自身的不足。AFLP标记由于其显性的遗传特性，不能区分ZW雌性和WW超雌个体，且在实际鉴定中有可能会出现由于假阴性，而对ZZ雄和ZW雌产生误判。而共显性的微卫星性别特异标记虽然可以准确鉴定ZZ雄、ZW雌和WW超雌个体，但由于其两条DNA片段条带之间差异较小，无法用琼脂糖凝胶电泳分辨，只能通过分辨力更高的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE胶）电泳的方法进行鉴别，而PAGE胶电泳的操作难度大、操作时间长、对实验设备和试剂等要求高、增加了遗传性别鉴定的成本、难度以及耗费的时间，难以在半滑舌鳎养殖场进行现场检测。因此，半滑舌鳎性别控制研究和高雌性苗种生产还需要一种能采用琼脂糖电泳方法准确分辨、能在养殖场现场应用的遗传性别快速鉴定的分子技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎性别特异性SCAR标记及其应用方法，即一种半滑舌鳎性别特异的微卫星SCAR标记，并建立一种能够在半滑舌鳎养殖场通过琼脂糖电泳的方法，快速准确鉴定出半滑舌鳎ZZ雄鱼、ZW雌鱼和WW超雌鱼的分子方法。

本发明首先提供一种半滑舌鳎性别特异微卫星标记，位于Z染色体上，全长169bp，其序列为：CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTCCTTGTTGCCTGTTGTTCTTACTCAGACCAGGCCTGCATGGGTGTATGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGCGCGCACGTGCATGTTCTGTGCTGATGTCCTTGTATAGTCAGGCCTGGGTTTATTTTCTCTGGATC（SEQ ID NO:1）。

上述微卫星标记还包括与SEQ ID NO：1相对应的W染色体上的序列。

本发明还提供一对SCAR标记引物，是基于SEQ ID NO：1的微卫星标记设计的，可以通过琼脂糖凝胶电泳清晰分辨雌、雄特异DNA片段，鉴定雌雄遗传性别，其中上、下游引物序列分别为:

5′-CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTC-3′；SEQ ID NO:2

5′-GATCCAGAGAAAATAAACCCAGG-3′；SEQ ID NO:3

将上述SCAR标记引物用于半滑舌鳎遗传性别快速鉴定，其步骤包括半滑舌鳎基因组DNA的提取、微卫星序列的PCR扩增、扩增产物的琼脂糖电泳检测。其特征为在雄性个体中扩增出一种大小为169bp的DNA片段；在雌性个体中扩增出两种大小分别为169bp和134bp的DNA片段；在超雌个体中扩增出一种大小为134bp的DNA片段。