[发明专利]可表达EGFP的重组J亚群禽白血病病毒感染性cDNA克隆、及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组J亚群禽白血病病毒，该重组病毒包括J亚群禽白血病病毒的所有编码基因，同时包括CMV和EGFP表达基因。本发明还涉及该病毒的制备方法及应用。本发明中的重组J亚群禽白血病病毒可以在DF-1细胞上进行良好的复制，并可应用于对J亚群禽白血病病毒中和抗体的高通量检测。

背景技术

1988年第一株ALV-J原型毒HPRS-103从英国的肉鸡中被分离到，基于其宿主范围，病毒囊膜干扰和交叉中和试验不同于A，B，C，D，E亚群而独立成为一个亚群，HPRS-103主要引起肉鸡产生以骨髓瘤为主的各种类型的肿1997年Flady报道了美国也出现了ALV-J感染肉鸡群的现象。1999年，ALV-J首次在中国肉鸡群中被分离到，随着ALV-J在中国鸡群中的传播，其对鸡群的影响日益严重，从最初感染肉鸡到能够感染蛋鸡，再到在蛋鸡群中大规模流行和爆发，具体表现在ALV-J导致有些蛋鸡群达到60%的发病率和超过20%的死亡率，并且造成产蛋率极巨下降，其临床上引起包括血管瘤，髓细胞瘤，组织肉瘤，成红细胞瘤等多种类型的肿瘤，给中国养殖业带来巨大的灾难。

ALV-J属于反转录病毒中的Al-pharetrovirusof家族，其前病毒基因组结构为5’-LTR-leader-gag/pol-env-rTM-DR1-E-LTR-3’，其中，5’UTR包括5’LTR和leader区域，gag，pol，env为编码基因，分别编码群特性gag蛋白，反转录酶/整合酶和亚群特异性的囊膜蛋白，其中gag蛋白被用来作为一种有效工具在肛拭子和蛋清中检测白血病，囊膜蛋白分为两部分，一部分为跨膜蛋白gp37，另一部分是与细胞受体结合有关的gp85，同时gp85包含hr1，hr2，vr1，vr2，vr3，所以其随着ALV-J在自然界的存在而出现了高度的可变性。ALV-J的3’UTR包括rTM，DR1，E元件和3’LTR，其对病毒的致病性和复制有非常重要的作用，因为这个区域包括可以影响宿主染色体和病毒基因表达的调控序列，这些调控序列存在于3’LTR及其上游序列。rTM是nonfunctional redundant transmembrane region的简称，其被认为是无功能区，DR1是一个正向重复元件，也可以在一些致瘤的肉瘤病毒中以单或双拷贝的形式存在，所以其被认为独特地存在于肉瘤病毒和ALV-J中，在ASV病毒中，因为DR1与未分裂RNA在细胞质中的积累有关，从而有选择的促进了分裂的srcmRNA水平，所以被认为与病毒的适应性有关系。与DR1相同，E元件也存在于一些肉瘤病毒中，有文献报道称由于E元件与src有非常紧密的联系，所以可能对ASV的致瘤起作用，但对于ALV-J，E元件只在特殊品系的鸡中有促进肿瘤形成的作用。

目前监测ALV-J中和抗体的方法为，将病毒与待检血清孵育，感作细胞，7天后检测通过ELISA或是免疫荧光的方法，若检测到病毒，则血清无中和抗体，若没有病毒，则血清存在中和抗体活性。这种方法都是通过7天后，再做一系列实验，才能得到待检血清中和活性，相对比较麻烦，而且要使用ELISA试剂盒或是ALV-J特异抗体和荧光抗体，相对浪费时间和实验经费，而通过构建可表达EGFP的重组J亚群禽白血病病毒，可以7天后，通过直接在荧光显微镜下观察荧光情况，来直观快捷的得知待检血清的中和活性情况。

针对目前分离的ALV-J病毒存在与其他病毒或与ALV其他亚群交叉感染的情况，构建单一起源的ALV-J的感染性克隆十分必要，这为以后ALV-J致病机理的研究奠定一定的基础。

发明内容

针对目前现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种可表达EGFP的重组J亚群禽白血病病毒感染性cDNA克隆，该感染性克隆一方面插入外源EGFP后不影响病毒复制，能够达到成功拯救J亚群禽白血病病毒的目的，另一方面了克服传统检测ALV-J中和抗体时复杂的过程，能够更加简单有效的进行ALV-J中和抗体的大规模检测。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种可表达EGFP的重组J亚群禽白血病病毒感染性cDNA克隆，其特征在于具有SED ID NO.1所示的核苷酸序列。

含有所述的可表达EGFP的重组J亚群禽白血病病毒感染性cDNA克隆的表达载体以及含有所述的表达载体的一种J亚群禽白血病病毒反向遗传操作系统也在本发明的保护范围之内。