[发明专利]一种用于防治枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于防治枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用，属于微生物制剂领域。

背景技术

植物枯萎病作为农业生产中常见的植物土传病害，具有发生面积广、发病时间短、危害程度大、防治难度高等特点，其致病菌可以在土壤环境中存活多年，抗逆性非常强。植物枯萎病给全世界的农业种植产生了严重危害，给农业生产带来了巨大的经济损失，广大植病工作者也一直在进行防治植物枯萎病的相关研究，试图寻找到一种安全、高效的防治方法。

目前植物枯萎病主要通过选育抗病作物品种、农业防治、化学防治和生物防治等方法进行。近年来，化学农药的使用带来的危害已被人们所熟知，生物防治越来越被人们接受以及重视。近些年出现了许多生防制剂产品，包括细菌源农药、真菌源农药、农药抗生素等。细菌源农药应用最为广泛，尤其是芽孢杆菌，作为生防材料主要是利用它的强有力的竞争作用，从整体上讲，许多生防芽孢杆菌不仅能防病而且有促进植物生长和增产作用。但是现有生防制剂普遍也存在以下几方面问题，1、生防制剂效果的稳定性较差；2、生防菌剂的有效保质期短；3、生防菌剂的生产技术问题，包括菌剂易污染、发酵条件严格、产品的剂型及产品的检测技术等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供了一种芽孢杆菌菌剂，用于防治植物枯萎病。本发明还公开了该菌剂的制备方法和应用。

本发明从28个不同属、种中筛选出最佳稳定共生菌种组合，通过单独培养筛选高产菌种。筛选出的菌种为枯草芽孢杆菌A-2（Bacillus subtilis）、枯草芽孢杆菌F-5（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌ZR-1（Bacillus amyloliquefaciens）、解淀粉芽孢杆菌ZR-8（Bacillus amyloliquefaciens）。

根据上述筛选结果，本发明提出了一种芽孢杆菌菌剂，包括：

优选地，所述芽孢杆菌菌剂由如下组分组成：

更进一步优选，所述芽孢杆菌菌剂由如下组分组成：

本发明所述的枯草芽孢杆菌A-2（Bacillus subtilis）、枯草芽孢杆菌F-5（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌ZR-1（Bacillusamyloliquefaciens）、解淀粉芽孢杆菌ZR-8（Bacillus amyloliquefaciens）均为北京沃土天地生物科技有限公司已售的，本领域技术人员可购买的产品。

本发明还提供了所述芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1).斜面培养：将枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8四种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20℃-37℃条件下，培养1-3天，使菌种活化；

2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，20℃-37℃条件下，100-200r/min摇床培养2-3天，单菌种液体培养OD₆₀₀值达到2.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；

3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-20%的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，20℃-37℃条件下，搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.5-1.5，培养2-3天，制得二级种子；

4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5-20%的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。

其中，在步骤1)中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；在步骤2）、步骤3）中所用的液体培养基为牛肉膏蛋白琼脂胨培养基。

其中，在步骤2）中，所述OD₆₀₀值优选为2.0-2.5；在步骤3）中，通气量优选为1：0.6-1.0；

步骤4）所述液体培养基的配方按质量百分比为：糖蜜5-10%、豆饼粉2-10%、蛋白胨1.0-5%、磷酸氢二钾1-1.5‰，余量为水。

在步骤4）中，所述的高密度发酵培养可以采用补料分批培养（FBC）方式，其中补料碳源为：葡萄糖、蔗糖、糖蜜中的一种或两种以上；氮源为：豆饼粉和/或蛋白胨。