[发明专利]一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测方法及应用，属于生物与新医药领域，具体方向是现代农业技术。

背景技术

抗苗勒管激素(anti Mullerian hormone，AMH)是一种只在性腺表达的水溶性糖蛋白，参与了苗勒管萎缩、睾丸沉降、颗粒细胞分化及卵泡募集调控过程，是控制卵泡数量和性别分化的关键因子之一。它由性成熟前睾丸足细胞和性成熟后卵巢颗粒细胞分泌。牛抗苗勒管激素是高度保守的蛋白质，前体由575个氨基酸组成，前导序列包含24-25个氨基酸，其中信号肽长度大约在16-18个氨基酸左右。碳端序列基本与其他转化生长因子B家族成员相同。转化生长因子B超家族蛋白质在距离碳端110个氨基酸左右具有一个特异性裂解位点，与转化生长因子活性有关。牛抗苗勒管激素前体在距碳端109个氨基酸处被裂解后形成一个110ku氮端同源二聚体和一个57ku碳端同源二聚体，前者可以增强后者的活性。

抗苗勒管激素在卵巢颗粒细胞中表达。雌性动物出生至青春期之前不表达抗苗勒管激素，性成熟后的雌性动物随着年龄增长，卵巢功能和AMH表达水平逐年退化。初级卵泡和小黄卵泡同质表达抗苗勒管激素，大卵泡只是在卵细胞以及窦泡周围的颗粒细胞表达抗苗勒管激素，闭锁卵泡以及膜细胞不表达抗苗勒管激素。动物在青春期之前性腺分泌抗苗勒管激素的模式存在明显的性别差异，血液中抗苗勒管激素浓度雄性的明显高于雌性的，青春期之后血液抗苗勒管激素浓度都降低，两性之间差别不明显。

抗苗勒管激素通过一种II型丝氨酸-苏氨酸激酶膜蛋白发挥其生物学效应，该蛋白被称作抗苗勒管激素II型受体(AMHR II)。AMHR II只在性腺表达，表明抗苗勒管激素只能以自分泌或旁分泌的形式发挥生理功能。像其它TGFB超家族成员一样，抗苗勒管激素通过两种受体、两个效应分子激活Smad信号通路。抗苗勒管激素首先与II型受体结合，有结构酶活性的II型受体使I型受体磷酸化并激活，I型受体再激活R-Smad，后者结合Smad4形成复合物并转运到细胞核，在细胞核复合物与靶基因(或报告基因)启动子Smad结合元件结合。利用Cre／loxP系统组织特异性灭活目标基因，证实2种I型TGFB受体，也就是Acvrl和Bmprla，以及3种Smad蛋白介导了抗苗勒管激素信号转导。

卵泡刺激素可以促进抗苗勒管激素表达。研究表明卵泡刺激素B亚基基因缺陷型小鼠青春期前血液中抗苗勒管激素水平较低，而当注射外源FSH之后，抗苗勒管激素水平恢复正常，提示FSH可能参与了AMH基因表达调控过程。GnRH颉颃剂可以降低窦前卵泡抗苗勒管激素表达水平；在排除内源GnRH和睾酮干扰的情况下，外源FSH可以提高血液中抗苗勒管激素浓度；低促性腺素性功能减退症患者在注射重组FSH后，精浆抗苗勒管激素表达水平升高。FSH通过PKA提高AMH基因表达水平，在huAMH基因转录起始位点上游存在NF-κB和A P2结合位点。将NF-κB或AP2位点诱发突变可以降低转录水平，并且敲除NF-κB位点也可以降低抗苗勒管激素表达水平。

抗苗勒管激素在卵泡发育过程中有着重要作用。卵泡发育主要由卵泡初始募集以及循环募集组成。在胚胎期初级卵泡的柱状颗粒细胞最先检测到抗苗勒管激素，之后卵泡持续表达抗苗勒管激素，高峰期出现在窦前卵泡以及窦腔小卵泡，大卵泡分泌量减少，闭锁卵泡检测不到抗苗勒管激素。抗苗勒管激素表达模式表明其在调节卵泡数量以及优势卵泡的选择方面有着重要作用。敲除AMH基因的表现为初级卵泡进入成长卵泡的速率增强，因而初级卵泡库过早的消耗殆尽。体外细胞培养试验证实抗苗勒管激素可以抑制初始卵泡的募集。抗苗勒管激素通过调节卵泡对FSH的敏感程度精细选择进入优势卵泡的次序。小鼠试验表明，缺少抗苗勒管激素时窦状大卵泡对FSH更加敏感。体外细胞培养试验证明抗苗勒管激素可以抑制FSH依赖的卵泡成长过程，颗粒细胞培养试验也表明抗苗勒管激素可以减弱FSH依赖的芳香化酶活性。在窦腔小卵泡，抗苗勒管激素浓度与雌激素浓度呈负相关，表明抗苗勒管激素生成与FSH活性密切相关。近来发现，AMH及AMHRII碱基变异可以改变窦腔卵泡雌激素产生过程并加速卵泡成长，表明抗苗勒管激素信号转弱可以增强依赖FSH的卵泡生长和激素合成过程。

抗苗勒管激素及其受体是影响家养动物繁殖性能的重要因素，群体内个体间抗苗勒管激素基因及其受体基因可能存在差异，这也是人工选择可以利用的地方。在培育高繁殖力高产品种及胚胎移植时，血液抗苗勒管素浓度可能成为有用的选择指标。