[发明专利]猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒2型抗体的免疫学检测，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，为无囊膜的单股负链DNA病毒，是已知的最小的动物病毒之一，主要分为2个基因型，即PCV1和PCV2。PCV1无致病性，广泛存在于猪群中。PCV2感染可引起多种疾病综合征，如断奶仔猪多系统衰竭综合征、怀孕母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪呼吸道疾病、猪皮炎和肾炎综合征、幼龄仔猪A 2型先天性震颤等疾病。PCV2是20世纪90年代初首先从出现断奶仔猪多系统衰竭综合征的病猪体内分离出的一种病原，如今已成为严重危害养猪业健康发展的主要病原之一，引起了国内外学者的广泛关注。我国自2000年报道首例猪圆环病毒感染以来，该病已普遍发生，表现为流行范围广，阳性率高，混合感染严重，种猪感染率高，在临床上表现为不同的临床综合征，已严重影响了养猪业的发展。

针对该病现有的检测方法主要有病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶技术，原位杂交（ISH），免疫胶体金技术，免疫荧光试验，免疫组化技术，抗原捕获ELISA，PCR和real time PCR等，各有优缺，且特异性差异较大。同时，方法对样品和人员的要求较高。由于猪感染猪圆环病毒2型或免疫猪圆环病毒疫苗均能产生相应的抗体，且抗体能较好的反应其免疫或感染病毒的情况，因此，可以通过检测PCV 的抗体来反应其免疫感染病毒情况。

AlphaLISA技术主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用。当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近时, 激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号。具体来说，在680nm 的激光照射下, 供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，发射波长为615nm。在生物分子不存在特异的互相作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。AlphaLISA技术凭借一种专有的基于微珠的技术，将传统的ELISA 转化为均相的“无需洗涤”的检测。

AlphaLISA技术所使用的稀土元素铕（Eu），发射波长非常尖锐，为615nm，从而大大减少了检测样品中杂质的干扰，可直接检测复杂样品（血清和体液）中的生物分子。在临床上，这非常适合测定人和动物的血清和体液样本。而此技术的高通量、高灵敏度、操作简便，能更准确、更省时的测定细胞因子等生物标志物。目前，已广泛用于药物筛选、细胞因子、病变基因、血清抗体等的检测。

中国发明专利申请（申请号为：201210031802.X，201210047016.9）分别公开了采用AlphaLISA技术检测肠道病毒71型衣壳蛋白（Anti-EV71 VP1 IgM）和甲型肝炎病 IgM 的方法。但是，目前尚无利用AlphaLISA技术检测猪圆环病毒2型抗体的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒，及编码试剂盒中抗原的基因，以及扩增该基因所使用的引物；本发明的第二目的是提供一种用于食品安全检测的猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测方法。

为实现第一目的本发明采用的技术方案是：猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒包括供体微珠、受体微珠、猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体及带His标签的Cap蛋白抗原。

其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE,AS101D（即Nickel chelate Donor beads(PE,AS101D)）；所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE,AL105C（即Anti-mouse IgG Acceptor beads(PE,AL105C)）；所述猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有与猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。

进一步，上述试剂盒包括供体微珠80μg/mL、受体微珠80μg/mL、猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体180nM/L及带His标签的Cap蛋白抗原100nM/L。使用时，以总体系20μL计，每孔添加量为：80μg/mL受体微珠3μL、80μg/mL供体微珠5μL、180nM/L带His标签的Cap蛋白抗原 5μL、100nM/L猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体 5μL及待测样本2μL。