[发明专利]蛹虫草素在猪小卵泡卵母细胞体外成熟培养中的应用

说明书

技术领域

本发明属于动物发育学领域，涉及蛹虫草素对猪小卵泡卵母细胞体外成熟培养中的应用，具体地说是蛹虫草素对猪小卵泡卵母细胞在体外成熟的GVBD、MⅠ、MⅡ时期，对母源基因的腺苷酸化进行不同程度的抑制作用，从而导致部分母源基因表达差异以及猪小卵泡卵母细胞体外成熟率的不同。

背景技术

随着转基因技术、细胞核移植技术、胚胎干细胞技术研究的深入，进一步推动了体外受精技术的迅速发展。然而卵母细胞数量有限，只有少量的卵母细胞应用于胚胎移植技术研究，极大地限制了繁殖新技术的应用。卵母细胞的体外成熟技术不仅可以再现体内受精过程，而且有利于受精机理的研究。卵母细胞的体外成熟技术可以为体外胚胎移植技术提供大量廉价的胚胎，有利于推动细胞核移植、转基因等技术的发展。

在卵巢中卵泡的大小、卵母细胞的直径与卵母细胞的体外成熟关系非常密切(Liu et al.2002;Lucas et al.2002;Griffin et al.2006)。许多研究结果表明，在非闭锁卵泡中，随着卵泡体积的增加，其卵母细胞的成熟率、受精率和囊胚发育率均随之提高。Melanie A.等（2007）的研究结果显示，来自5-8mm卵泡的卵母细胞囊胚发育率几乎是<3mm的小卵泡卵母细胞的三倍（55%比17%）。小卵泡卵母细胞作为能够提供巨大资源卵泡卵母细胞在近几年来越来越受到国内外学者的关注。进入九十年代以后，小卵泡卵母细胞的体外培养技术有了进一步的发展。国内外的众多学者通过研究，建立了很多小卵泡卵母细胞的体外培养技术，然而这些技术大多在卵泡卵母细胞体外培养方法的基础上建立起来的。对猪小卵泡卵母细胞培养技术的建立较晚，直到1975年Tsafriri A等首次取卵泡大小在1-2mm的卵母细胞进行培养，培养的成熟率只有15%～25%。

蛹虫草素(cordycepin)又称虫草菌素、3’-脱氧腺苷（3’-dA），是蛹虫草中（尤其是核苷类）主要活性成分，也是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。在正常的卵母细胞成熟过程中基因表达控制主要是转录后水平，主要是受到细胞质的多聚腺苷酸化的影响，这个过程对于保护mRNA不受降解及激发它们进行翻译起着重要的作用(Bettegowda and Smith,2007;Zhang et al.,2009)。3’-dA能够通过脱腺苷化致使mRNA的降解(reviewed in Bettegowda and Smith,2007)。从而影响卵母细胞成熟的过程中mRNA的稳定性和翻译效率，在早期胚胎发育时基因组激活之前或之后会影响mRNA的变性。Krischek和Meinecke(2002)研究表明，牛卵母细胞体外成熟需要母源基因的多聚腺苷酸化。因此对于大卵泡卵母细胞培养过程中，多聚腺苷酸化的抑制作用会导致成熟率以及成熟质量的下降。

发明内容

本发明提供蛹虫草素在猪小卵泡卵母细胞体外成熟培养中的应用。

本发明采取的技术方案是：蛹虫草素在猪小卵泡卵母细胞体外成熟培养中的应用。

本发明所述猪小卵泡卵母细胞的收集方法是：卵巢采于刚屠宰母猪的卵巢，放入含75mg/ml青霉素和50mg/ml链霉素的37℃生理盐水中，并在2小时之内用生理盐水清洗2～3次；在无菌操作室内用18号针头的注射器抽取直径<3mm的小卵泡的卵母卵丘复合体，在显微镜下挑取有3～5层颗粒细胞包裹，细胞质均匀，透明带完整的卵丘卵母细胞(COCs)复合体。

一种猪小卵泡卵母细胞体外成熟培养的方法，包括下列步骤：

（1）猪小卵泡卵母卵丘复合体的收集

卵巢采于刚屠宰母猪的卵巢，放入含75mg/ml青霉素和50mg/ml链霉素的37℃生理盐水中，并在2小时之内用生理盐水清洗2～3次；在无菌操作室内用18号针头的注射器抽取直径为<3mm卵泡的卵母卵丘复合体，在显微镜下挑取有3～5层颗粒细胞包裹，细胞质均匀，透明带完整的卵丘卵母细胞复合体；

（2）猪小卵泡卵母细胞体外成熟培养液的配制及培养

配制培养液，基础培养基为TCM-199，平衡之前加入0.1%PVA(w/v)，3.05mM D-葡萄糖,1mM丙酮酸钠，0.57mM半胱氨酸,10ng/ml EGF,10IU/ml PMSG，10IU/ml hCG，75mg/ml青霉素，50mg/ml链霉素，最后添加蛹虫草素终浓度为2μg/ml；