[发明专利]水稻条纹病毒p3基因用于制备转基因抗白叶枯病植物体的应用有效
申请号: | 201310470167.X | 申请日: | 2013-10-10 |
公开(公告)号: | CN103497956A | 公开(公告)日: | 2014-01-08 |
发明(设计)人: | 燕飞;吴根土;杨勇;严成其;陈剑平 | 申请(专利权)人: | 浙江省农业科学院 |
主分类号: | C12N15/34 | 分类号: | C12N15/34;C12N15/84;C12N1/21;A01H4/00;A01H5/00 |
代理公司: | 杭州丰禾专利事务所有限公司 33214 | 代理人: | 王从友 |
地址: | 310021 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 水稻 条纹 病毒 p3 基因 用于 制备 转基因 抗白叶枯病 植物体 应用 | ||
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域及植物病害防治领域,尤其涉及水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)P3基因在植物抗白叶枯病中的应用领域。
背景技术
水稻条纹病毒(Rice Stripe virus, RSV)是由灰飞虱传播的一种重要水稻病毒,由该病毒导致的水稻条纹叶枯病在我国持续发生,造成严重经济损失。近年来,我国科学家针对RSV的生物学和分子生物学研究开展了一系列细致而深入的工作:测定了病毒全基因组序列、鉴定了病毒沉默抑制蛋白、运动蛋白、开展了水稻互作蛋白的分离筛选工作、建立了灰飞虱饲毒、检测技术、综合防治技术等工作,这些工作所取得的进展加深了人们对于RSV致病机制的了解。RSV的p3基因编码一个沉默抑制蛋白,通过与siRNA结合起到抑制RNA沉默的作用。
水稻白叶枯病(bacterial blight)由黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起,是一种世界性的重要稻病,在全球各稻区几乎均有发生。在我国,白叶枯病同纹枯病、稻瘟病被列为水稻三大病害,对我国水稻生产危害极大,一直是影响我国水稻高产、稳产的一个严重性病害。据统计,在发病较重的年份和地区该病引起的水稻减产高达50%甚至绝收。
防治水稻白叶枯病的最经济有效的措施是选育和种植抗病品种。传统的防治方法是通过不断更换农药品种以及加大农药使用量来防治稻瘟病,这对生态环境和人类健康产生压力。利用植物基因工程可向现有栽培品种中导入外源基因而不受种属限制,拓展可利用基因的来源,为作物抗病育种工作开辟了一条崭新而有效的途径。
发明内容
为了解决上述的技术问题,本发明的第一个目的是提供水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因用于制备转基因抗白叶枯病植物体的应用。本发明的第一个目的是提供一种抗白叶枯病的水稻的制备方法。
为了实现上述的第一个目的,本发明采用了以下的技术方案:
水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因用于制备转基因抗白叶枯病植物体的应用。该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。该基因来源于水稻条纹病毒,通过GenBank序列比对设计引物从我们田间采集的水稻病株上序列扩增而来。作为优选,该基因用于制备抗白叶枯病水稻。
为了实现上述的第二个目的,本发明采用了以下的技术方案:
一种抗白叶枯病的水稻的制备方法,该方法采用包含水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因的宿主细胞对水稻成熟胚进行的遗传转化获得。作为优选,所述的宿主细胞由包含水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因的植物表达载体转化。作为再优选,转化菌株为农杆菌菌株EHA105。
作为优选,所述的宿主细胞的制备方法包括以下的步骤:
(1) 水稻条纹病毒p3基因的克隆及载体构建
通过GenBank中的RSV p3序列分析,设计如下引物用于从田间采集的RSV侵染水稻病株中扩增得到水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因,该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示,引物设计时已加入酶切位点,用于将p3基因重组到双元表达载体pCV1300中;引物序列如下:
P3 (+): 5’- T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5’- G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’;
(2) 转化农杆菌
取-70 ℃保存的EHA105农杆菌感受态,置冰上融解;取1μl抽纯pCV-P3-C质粒加入到100 μl感受态中,混匀,加入到处理好的电击杯;设置2200V电压,电击转化;点击完成加入900 μl的液体YEP培养基,28 ℃,200 rpm摇床培养1.5 h,菌液涂布在含50 μg/ml卡那霉素和100 μg/ml利福平平板上,28 ℃培养至形成单菌落。
作为优选,所述的抗白叶枯病的水稻的制备方法包括以下的步骤:
1) 菌液的准备
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- 王春来;李刚;谢芳;张艳禾 - 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
- 2013-09-10 - 2013-12-18 - C12N15/34
- 本发明公开了突变的噬菌体裂解基因E、含有该裂解基因的裂解质粒载体和在制备菌影疫苗中的应用。本发明的一种突变噬菌体裂解基因E(Eprom)是通过将噬菌体phiX174的裂解基因E的启动子区进行突变后获得的,突变后的E基因使得培养菌的温度从现有的28℃变成37℃,而且具有更高的裂解效率、更高的起始诱导浓度和规模化生产能力,发酵罐培养裂解效率高达99.99997%。将Eprom与pBV220连接后即得高效裂解质粒载体pBV-Eprom。将pBV-Eprom转化到胸膜肺炎放线杆菌中,诱导Eprom基因表达,得到胸膜肺炎放线杆菌菌影。本发明的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的安全性和免疫保护效力,可以刺激机体产生高滴度的抗体,且能够对不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌强毒株的攻击提供良好的交叉免疫保护。
- 密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因及其应用-201310417968.X
- 郑其升;赵晓云;陈瑾;乔绪稳;李鹏成;侯立婷;于晓明;侯继波 - 江苏省农业科学院
- 2013-09-13 - 2013-12-18 - C12N15/34
- 本发明提供密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因及其应用,属于分子生物学领域。所述Cap蛋白编码基因如SEQ ID NO:1。含有所述基因的重组载体、重组菌。制备猪圆环病毒2型病毒样颗粒的方法,诱导重组菌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白,将重组菌裂解,取裂解液,纯化后获得猪圆环病毒2型病毒样颗粒。以所述病毒样颗粒为活性成分的基因工程亚单位疫苗。密码子优化的猪圆环病毒2型Cap能够实现大量可溶性表达。病毒样颗粒(VLP)由Cap蛋白组装而成,具有良好的免疫原性。采用本发明病毒样颗粒制备的疫苗,可预防猪圆环病毒2型感染,具有免疫原性好、抗体水平较高、攻毒后能够起到有效保护的优点。
- 再测序病原菌微阵列-201310112018.6
- 布赖恩·艾格;埃里克·H·汉森;拉塞尔·P·克鲁泽洛克;林宝钏;罗伯·罗利;司徒登;大卫·斯坦杰;詹尼弗·约翰逊;克拉克·蒂贝特斯;德宗·撒奇;加里·沃拉;伊丽莎白·沃特;王征 - 海军秘书处代表的美国政府
- 2005-07-05 - 2013-07-31 - C12N15/34
- 本发明是关于通过采用DNA再测序微阵列进行病原菌探测和鉴别的方法。本发明也提供了再测序微阵列芯片,用于生物样本中存在的病原菌的区分诊断和血清类型分类。本发明进一步提供了探测生物样本中存在病原菌和鉴别病原菌的方法。本发明也提供了计算机实施生物序列辨识器(CIBSI)系统和依据至少一种筛选参数从生物序列数据中筛选子序列的方法。至少一种筛选参数对应从类似的筛选中获得有意义结果的一种可能性。
- 大肠杆菌来源的PCV2 ORF2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备-201310076992.1
- 袁于人;莫小兵 - 斯澳生物科技(苏州)有限公司
- 2013-03-11 - 2013-06-26 - C12N15/34
- 本发明涉及经大肠杆菌表达密码子优化的猪圆环病毒PCV2 ORF2基因和大肠杆菌来源的PCV2 ORF2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备方法。
- 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用-201210369096.X
- 钱平;李祥敏;彭波;陈焕春 - 华中农业大学
- 2012-09-27 - 2013-05-29 - C12N15/34
- 本发明公开了一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用,参照PCV2b分离株ORF2基因序列,人工合成ORF2基因,以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒为骨架,将合成的ORF2基因基因连入该质粒,得到一种杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2,取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2与DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合,筛选阳性菌落,得到重组杆粒rBac-PCV3ORF2,将该杆粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2。重组杆状病毒高效地表达PCV2ORF2蛋白并形成病毒样颗粒。本发明的重组杆状病毒所表达包装形成的VLP制备灭活疫苗,免疫28日龄仔猪后可诱导机体产生特异性免疫反应,并能完全保护猪体免受圆环病毒强毒的攻击。
- 编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用-201310065186.4
- 李鹏成;郑其升;乔绪稳;陈瑾;侯继波 - 江苏省农业科学院
- 2013-03-01 - 2013-05-15 - C12N15/34
- 本发明提供编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用,属于分子生物学领域。编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因,含有SEQ ID NO:1所示的序列。本发明还提供含有上述基因的重组表达载体,含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。该复合物制备方法为:培养重组菌,破碎获得裂解液上清,纯化后获得含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。本发明将Cap蛋白编码基因进行了密码子优化,所以重组Cap蛋白能够高产、高效、可溶表达;由于上述复合物含有肽聚糖锚钩蛋白PA,有利于后续纯化。本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白活性良好,含有该重组蛋白的复合物免疫小鼠后可产生高水平的猪圆环病毒2型特异性抗体。
- 专利分类