[发明专利]一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法

权利要求书

1.一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（1）水稻种子去颖壳，消毒；

（2）消毒种子在1/2MS培养基上培养10-15天，待其长成15-20cm高的幼苗；培养条件：25℃，光照12h，黑暗12h，光照强度：8000Lux；

（3）取水稻幼茎，剥去叶鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入渗透剂，暗条件放置20-30分钟；所述渗透剂为0.3mol/L山梨醇和50mM氯化钙的混合液TVL；

（4）加入酶解液酶解细胞壁以获得原生质体；具体方法如下：在室温22-25℃条件下，将酶解液加入的水稻幼茎和渗透剂的混合液中，真空抽滤1h；然后置于水平摇床上60r/min摇4h；

（5）用25um的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，4℃滤液静置30min以上，待溶液分层；

（6）吸取中层10ml的原生质体，用10mlW5溶液洗涤，100g离心5-10min，弃上清，2-3次，即获得较为纯净的原生质体；

（7）原生质体转化：以终浓度为20%的PEG为媒介，将带有35S驱动的增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pSTAN1转化进入原生质体：转化体系如下：10ul质粒，100ul原生质体用MMG溶解，110ul40%的PEG-Cacl₂；室温放置5-15min，然后加入W5溶液至反应体系的总体积为1ml以终止反应；100g离心5min，去上清；再加入1ml W5悬浮原生质体，于25℃黑暗条件下培养2-24小时。

2.根据权利要求1所述的快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于：所述的消毒方法如下：体积百分比为70%酒精洗30s；蒸馏水洗一次；体积百分比为50%NaClO摇洗30min；灭菌蒸馏水洗8-10次。

3.根据权利要求1所述的快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于：所述的酶解液为3%纤维素酶R-10和0.6%果胶酶R-10、1M蔗糖、pH5.7的0.2M MES、1M二水氯化钙、2M氯化镁配制成的混合液，55℃温育10min，使蛋白酶失活，冷却后过滤除菌。

4.根据权利要求1所述的快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于：转化时，原生质体需预先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液悬浮，MMG由4mM MES pH5.7，0.4M Mannitol，15mM MgCl₂组成，转化采用的媒介为PEG，由40%PEG4000，0.2M Mannitol，100mM CaCl₂组成。