[发明专利]高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法及其应用。 

背景技术

亨廷顿病(Huntington’s Disease,HD)是一种人类常染色体显性遗传的神经退行性疾病，主要发生在中老年人群，患者的行为能力和认知水平障碍。该疾病的发生，不仅给患者带来身心的痛苦，导致患者的死亡，而且给患者的家庭带来巨大的经济负担。随着老龄化社会的到来，患亨廷顿疾病的老年人群的比例也在增大，因此干预、缓解亨廷顿疾病的发生及发展，有着十分重要的意义。 

现已查明，亨廷顿病是由HD基因突变，即HD基因第一外显子中CAG重复序列异常扩增，其表达产物—亨廷顿蛋白(huntingtin，HttQ)氨基端的多聚谷氨酰胺（PolyQ）异常延伸导致的。正常情况下，人表达的正常的HttQ蛋白含PolyQ的长度少于35个谷氨酰胺，正常的HttQ蛋白可弥散分布在神经元胞质内，并不引起人的发病。然而，在患者体内表达的异常HttQ蛋白的PolyQ长度超出一定阈值，即＞35，其表达产物（HttQ蛋白）发生异常聚集，进而对神经细胞产生毒性而使患者发病。在HD患者和HD动物模型的脑组织（或神经元）内，突变的HttQ蛋白聚集形成了淀粉样斑块或形成包涵体。可见，HttQ蛋白中的PolyQ长度与患者发病年龄相关。PolyQ在正常人群中短于35个，在HD患者中突变Htt的PolyQ长度超过36个。在HD成年患者中约为40～50个，老年患者中则＞55个。 

亨廷顿病的发生与亨廷顿蛋白(HttQ)内的多聚谷氨酰胺（PolyQ）长度、多肽的构象变化（形成β-片层）、形成的多聚体及其在神经元内形成的淀粉样斑块沉淀直接相关。亨廷顿蛋白(HttQ)内多聚谷氨酰胺（PolyQ）长度变化是引起亨廷顿疾病发病的重要因素之一。因此，以HttQ为靶点，获得具有抗HttQ蛋白聚集的活性物质及先导性药物，对预防和干预亨廷顿疾病的发生及发展有重要意义。 

从大量天然产物或化合物文库中获得抗HttQ蛋白聚集的活性物质通常采用以下几种模型，如体外模型、E.coli模型、酵母模型、哺乳动物细胞模型及果蝇、线虫和哺乳动物模型等。在实践中，这些模型显示出各自的优点和不足。 

如，利用HttQ蛋白的体外聚集模型可以筛选出抗HttQ蛋白聚集的活性分子。Heiser V等利用聚集的HttQ51蛋白不溶于SDS的特性，采用自动滤过阻滞系统对数万种化合物文库进行初筛，从中获得了一些可减缓HttQ51聚集的化合物或天然产物。进一步的实验发现，体外实验表现活性的部分化合物在细胞模型中未表现出抗HttQ51聚集的作用，有的化合物甚至表现出细胞毒性。可见，利用体外模型筛选出可直接抗HttQ蛋白聚集的活性物质，还需在细胞模型或动物模型上进行进一步的活性鉴定。应当指出的是，要获得大量商品HttQ蛋白，需花费高昂的费用；即使可以通过体外表达HttQ蛋白，也需要重组菌发酵、蛋白质诱导表达及冗长的纯化工作，工作量大，所涉及的费用高。