[发明专利]芒属植物快速切片染色的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物切片的技术领域，涉及一种植物切片染色的方法，更具体地说是涉及一种芒属植物快速切片染色并用于镜检的方法。

背景技术

生物质是继煤炭、石油之后，世界第三大能源（Liang，2000），生物质资源储量非常丰富，每年生物质能源为全世界提供了14％的能源，并成为世界上约15亿人口赖以生存的主要能源（KOUFOPANOS，1989）。如今，利用多年生草本植物发展生物质能源产业是可再生能源发展的一个新方向。关于木质纤维素能源植物的研究近年来受到普遍关注，纤维素类原料是地球上最丰富的可再生资源，植物干重的35%～50%是纤维素，20%～35%是半纤维素，还有5%～30%是木质素。全球光合作用产生的植物生物量每年高达1.1×1012t，纤维素原料占全球生物量的60%～80%（袁振宏，2005）。近些年来，全世界正努力利用可生物降解及对环境友好的天然纤维用于非传统用途，这引起了人们对这些纤维新的研究兴趣（Bassam，1998；Venendaal，1997）。例如用油菜、大豆、玉米、甘蔗、甜高粱等作物来生产生物柴油或纤维乙醇，用这样的可再生清洁能源来替代化石燃料（杜风光，2007）。因此通过测定不同植物的木质纤维素含量，可以发掘更多能源植物（孙智谋，2007；永安东，2003）。芒属植物因其高生物产量、强适应性等特点，作为纤维素类能源资源，具有极大的开发潜力。

纤维素是一种直链多糖，水解可得到葡萄糖，再经酵母发酵可得乙醇。半纤维素是戊糖（含木糖、阿拉伯糖）、己糖（含甘露糖、葡萄糖、半乳糖）和糖酸所组成的不均一聚糖，为异质多糖，结构和纤维素不同，水解后产生混合糖。木质素是一种高分子芳香族化合物，不能水解成糖，但可用作燃料。纤维素和半纤维素的降解利用主要受到分子间大量氢键的制约，同时也受到其与木质素间的化学键的影响（谢新明，2008）。目前，国内外很多学者认为，降低木质素含量，提高纤维素含量，这对木质纤维素的降解和转化乙醇非常有利。但木质素含量过低，对植物的生长发育又有影响。而植物中纤维素、半纤维素和木质素形成过程都与维管束的生长与消失过程有明显关联，对维管束的生长情况只有通过制片后经显微镜观察得到。

目前，植物制片前需要进行前处理，将植物材料进行切成便于观察的薄片才行，有两种方法进行：一种为徒手切片法、另一种为石蜡切片法。徒手切片是用手持双面刀片或剃刀，将新鲜材料或预先固定好的材料（切前水洗）切成薄片，不经染色或经简单染色后，用水封片作临时装片观察。徒手切片法的优点是不需要复杂的设备，方法简便，制片迅速，而且能观察到植物组织的自然色泽和活体结构，常用于研究植物解剖结构、细胞组织化学成分，植物资源鉴定等。同时，它具有利于临时观察、能够较快的得到结果的优点。缺点是对于体积过小、太软、太硬的材料则难于切片，而且不能制成连续切片。

而石蜡切片法是最常用的一种制片法。其制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。石蜡制片是一个连续的操作过程，往往要连续几天才能完成，容易与其它工作发生冲突，也会因前后顺序颠倒或超过了规定的时间，给科研工作带来不小的损失。制片的各个步骤都是互相关联的，如脱水不彻底就会影响到透明的程度，以至影响蜡块的质量。

本试验运用快速切片法，通过显微镜观察在田间可以观察到不同时期的芒属茎段生长情况，了解芒属植物资源在纤维素、半纤维素和木质素形成过程中维管束的生长与消失过程，可为今后该类植物的遗传育种工作中选择亲本材料提供参考依据，并为大面积推广种植芒属植物，推动其工业化利用奠定一定的基础。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种方法简单、成本低、便于快速化镜检，准确率高的快速切片方法，可用于显微镜观察。

本发明采用的技术方案包括：取新鲜的芒属植物茎段3-10cm，经酒精浸泡、适度软化处理、切片、对切下的薄片进行染色、固定、脱色后再次染色后制片用于显微镜观察。

因此，本发明提供芒属植物快速切片染色的方法，其具体步骤包括：

(1)取新鲜的芒属植物茎段3-10cm用70%的乙醇浸泡30秒，加入50-60%丙二酸水溶液进行软化处理30-60min；

(2)将材料取出，用氢氧化钠溶液浸泡5-10min，用蒸馏水冲洗三次，再用带柄手术刀快速切片，得到大量的芒属植物茎段薄片；

(3)对切下的薄片进行用蒸馏水冲洗两次，加入1%番红染色1h；