[发明专利]一种血液和尿液中亚硝酸盐的高灵敏快速检测方法

说明书

技术领域

    本发明属于体内药物检测技术领域，具体涉及一种血液和尿液中亚硝酸盐的高灵敏快速检测方法。 

背景技术

   一氧化氮（NO）是一种带有不成对电子的气体，化学性质不稳定，半衰期很短，仅有几秒钟，易形成亚硝酸盐和硝酸盐。NO是目前所知的最强的血管舒张因子和收缩因子，它能作为介质、信使、递质或细胞功能调节因子参与集体许多生理或病理过程。 NO是调节心肌正常生理活动的重要分子，具有使血管扩张，抑制血小板聚集与黏附，抗炎症，抑制细胞凋亡、增生等作用。人类有60 万亿细胞，一氧化氮在人体内扮演着细胞间的传导因子的角色，也是重要的“信号分子”。作为相对稳定的NO代谢产物，亚硝酸盐（NO₂^-）在最近10年成为世界医学界的热点，通过测定尿液、血液中的NO₂^-的含量来反映体内NO含量和作为反应多项身体机能的重要指标或疾病诊断。 

目前亚硝酸盐检测最通用的方法是食品安全国家标准GB 5009.33- 2010，该标准第一法中采用离子色谱法检测各类食品中的亚硝酸盐和硝酸盐，第二法为分光光度法。同时，亚硝酸盐的测定还有荧光光度法、高效液相色谱法等。食品中亚硝酸盐一是含量相对高，二是基本没有盐的干扰，离子色谱法及光度法都是较适合的检测方法，而体内血液或尿液中亚硝酸盐却含量低，有较高盐含量，基体干扰严重。目前检测通常用Griess检测试剂盒，由于受到检测灵敏度的限制及基体干扰，通常很难检测出亚硝酸盐，其灵敏度通常只能达到1μg/mg。研究小组之前已利用高效液相色谱(HPLC)对血液尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐检测进行了研究，取得了不错的效果，申请了发明专利（201310129291.X），同时还将亚硝酸盐与Griess试剂反应，经浊点萃取（CPE）进行分离、富集，直接目视比色，进行血液尿液中亚硝酸盐简单快速检测，申请了发明专利（201310274145.6）。进一步更加深入研究发现，用非离子表面活性剂AEO系列作浊点萃取剂，与Triton系列及其他非离子表面活性剂相比，该表面活性剂能达到相似或更高的萃取效率，由于不含芳环，更加环保、环境中易降解，同时本发明通过研究发现几种有机醇可以使AEO系列浊点温度降低，分相时间更短，具有检测更加快速简便、灵敏的特点。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单快速、灵敏度、能现场检测、尿液中亚硝酸盐定性、半定量的方法。 

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。 

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。 

一种血液和尿液中亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤： 

（1）亚硝酸盐标准色阶制作：取浓度为5.0μg/mL 的NO₂^-   标准溶液0.005、0.01、0.05、0.10、0.30、0.70、1.0mL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL，加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心分相，在溶液上层出现由浅至深的红色环色阶溶液；

（2）样品检测： 

尿液的检测：取10mL尿液，加入蛋白沉淀剂硫酸锌0.4～1.0g，活性炭0.5～1.0g，混合均匀，离心脱色、脱蛋白，滤纸过滤除去脱色剂和蛋白沉淀剂；取5mL处理后的尿液，加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心分相，将溶液上层表面活性剂的颜色与步骤（1）标准色阶比较，判断其含量；