[发明专利]柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)合成表1所示的引物：

表1所用到的引物

(2)提取柱状黄杆菌基因组，以柱状黄杆菌的基因组DNA为模版，以表1所示的引物进行PCR扩增表达片段；

(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，分别连接到pMD-18T质粒上；

(4)pMD-18T质粒分别进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取pMD-18T质粒并进行双酶切，所使用的酶如表1所示；电泳切胶回收酶切片段；

(5)将酶切下来的五个基因片段以等体积混合，使用T4连接酶进行连接；

(6)将连接产物使用引物maz+和clsA-进行PCR扩增以获得五个基因的连接产物；

(7)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，将回收片段连接到pMD-18T载体上。

(8)对步骤(7)的pMD-18T载体进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切，所使用的酶为NcoI和SacI，电泳回收酶切片段；

(9)将步骤(8)中双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pET-32(a)表达载体连接；

(10)连接产物转化DE3感受态细胞，PCR筛选重组克隆；

(11)取阳性克隆菌液1：100接种于LB(含100μg／mL氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇床振荡培养至OD600为0.4～0.6。

(12)加入IPTG至终浓度为0.5mM，培养6h；4℃，5000g离心15min，去上清，收集菌体；用PBS重悬沉淀，4℃，10000g离心15min，去上清；加入1×结合缓冲液重悬菌体，冰上超生波破碎，200W，30s超声，30s间隔，8个循环；4℃，10000g离心15min，去上清，沉淀用含8M尿素的1×结合缓冲液重悬。冰上放置1h，使其彻底溶解；4℃，10000g离心30min，保留上清；

(13)将树脂充分重悬，取悬液加到沉降柱中；依次3体积去离子水；5体积离子化缓冲液(50mmol／L NiSO4)润洗；3体积结合缓冲液(0.5mol／L NaCl，5mmol／L Imidazole，20mmol／L Tris-HCl，pH7.9)润洗；待结合缓冲液降至层析介质表面时，加入制备好的上清样品，流速为每小时10倍床体积，10体积结合缓冲液漂洗，6体积漂洗缓冲液漂洗，6体积洗脱缓冲液洗脱目标产物，目标产物经得到可柱状黄杆菌基因重组疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法所制备的柱状黄杆菌基因重组疫苗。

3.权利要求2所述的柱状黄杆菌基因重组疫苗在制备预防草鱼柱状黄杆菌感染的疫苗中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，当年的鱼苗养至8-10cm时，采所述的疫苗进行免疫，免疫方式为采取腹腔注射的方法的给予，每尾注射0.2mL。

5.根据权利要求4所述的应用，在首次免疫后间隔一个月进行加强免疫一次，免疫剂量与第一次相同。