[发明专利]一种创建甘蓝型油菜突变体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物育种技术领域，具体是指一种创建甘蓝型油菜突变体的方法。

背景技术

甘蓝型油菜是世界上最重要的油料作物之一，也是十字花科植物遗传研究的典型材料。诱变可以产生丰富的突变体，现已广泛应用于植物遗传育种和生物学研究。诱变技术也较早地应用在油菜育种中，空间搭载通过辐射、化学诱变、空间搭载等方法，已经获得了生育期、长角果长、丰产、高油、花形态、抗除草剂、抗病、叶片黄化等不同类型的变异种质资源,丰富了基因库,并应用于品种选育之中。但至今尚未发现直接利用白菜型油菜和甘蓝种间杂交创建甘蓝型油菜新变异的报道。

现有的诱变技术方案主要包括3种类型，分别是物理辐射诱变、化学诱变和航空诱变。物理辐射诱变、化学诱变和航空诱变技术现被广泛应用于农作物育种，使用诱变技术能使作物产生有益变异，从而获得与育种目标相符的性状，据FAO/IAEA(加06)的突变品种数据库(MVD)统计，目前在线登记突变品种2541个，其中油料作物63个，油菜占25个，突变品种的问世和突变基因的扩散促进了各国的农业生产和经济发展。

辐射诱变和化学诱变虽然能够创建突变体，但是所用的物理射线和化学诱变剂对环境以及人体会造成较严重的损伤，在使用中对实验条件和操作技术要求非常严格，普通实验室很难具备理化诱变条件，一般的实验人员也不具备理化诱变技术，因此，这一技术在普及上有难度。同样，空间搭载存在着成本高、门槛高等难题，导致一般实验室也很难应用。

发明内容

本发明的的目的就是为了解决上述现有技术中的不足之处，提供一种新型创建甘蓝型油菜突变体的方法。

本发明所述一种新型创建甘蓝型油菜突变体的方法，其方法包括如下步骤：

（1）有性杂交

以白菜型油菜和甘蓝为父母本，分别进行正反交，于每蕾开花前1-3天进行剥蕾去雄，去雄后立即授粉一次，次日重复授粉一次；

（2）幼胚抢救

授粉10天后，每天剥开角果在体式显微镜下观察胚珠发育状态和幼胚发育进程，找准幼胚凋亡临界期，于幼胚凋亡前2-3天取回角果用84消毒液灭菌15分钟，再用无菌水清洗三次后将角果放于无菌滤纸上剥出幼胚种于固体培养基，培养基成分为MS基本培养基+1.2mg/L6-BA+0.25mg/LNAA；

（3）快繁继代

在MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA培养基进行快繁，将一颗杂种苗增殖为3个以上的拷贝，为了防止长期连续培养导致杂种苗玻璃化和老化，进行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA两种培养基交替培养继代；

（4）染色体加倍

幼嫩的小苗转入添加有100mg/L秋水仙素的MS培养基中培养12天左右，具体时间视苗子的长势而定，一般来说当幼苗的顶端明显变粗时即可停止处理，将处理的幼苗连同愈伤组织一同转入新鲜的快繁培养基中直到从愈伤组织中分化出新苗；

（5）变异筛选

从创建的异源四倍体（新型的甘蓝型油菜AACC）第一代开始，观察并记录叶型、叶色、株高、株型、花色、花瓣大小、角果长度、籽粒大小、初花期、终花期、成熟期、花粉育性、自交亲和性等性状不同世代变异情况，同时利用AFLP分子标记检测新型甘蓝型油菜基因组水平变异情况，分子水平检测到的变异一方面可以与形态上可见变异相互印证，另一方面可以通过分子检测发现更多的中性突变；AFLP分子标记按照Saghai-Maroof等的CTAB法提取样品DNA，参照Vos等报道的方法进行AFLP分析,首先利用5U EcoR I和2U Mse I限制性内切酶(反应体积为25μL)在37℃水浴酶切DNA,酶切片段两端连接人工接头E-F:5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'、E-R:5'-AATTGGT

ACGCAGTC-3'、M-F:5'-GACGATGA GTCCTG AG-3'和M-R:5'-TACTCAGGACTC

ATC-3'，用预扩增引物扩增连接产物,将预扩产物稀释后利用选择性扩增引物进行扩增，选扩产物变性,聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显影,筛选出新型甘蓝油菜。