[发明专利]中度嗜盐菌株及由该菌株产生的嗜盐酯酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株中度嗜盐菌株、嗜盐酯酶及其应用，特别是从山东威海双岛盐场筛选得到的一株高产嗜盐酯酶的中度嗜盐菌株及由该菌株产生的新型嗜盐酯酶及其应用，属生物技术领域。

背景技术

嗜盐菌是极端环境微生物的重要组成部分之一，主要指中度嗜盐菌(最适生长盐度为3%-15%)和极端嗜盐菌(最适生长盐度>15%-30％)。嗜盐菌存在于多种多样的盐域环境中，这类环境有自然形成的，如死海，盐湖等水环境、盐土环境，人工形成的如盐场、盐池等，还有很多盐腌制的食品、绘画材料和建筑材料等。我国有广阔的盐域环境和丰富的嗜盐微生物资源。作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，嗜盐菌近年来受到人们的广泛关注。

大多数生物工艺所用的酶都来源于非极端环境的微生物，为了得到在苛刻工业条件下具有最佳催化作用的酶，要通过蛋白质工程对这些酶进行改造，使之具有更好的热稳定性，对有机溶剂具有更强的耐受性等特性。嗜盐酶是由嗜盐菌产生的，通常具有极高的盐耐受性和较高的热耐受性，因而以嗜盐菌作为产酶资源正成为一个新的研究热点，应用于处理海产品、酱制产品以及化工、制药、石油、发酵等排放含高浓度无机盐废水的工业部门。

细菌产生的脂肪水解酶根据水解底物的不同划分为水解短链羧酸酯(小于12个C)的酯酶(carboxylester hydrolases，esterase，E.C.3.1.1.1)、可以在油水界面上水解长链甘油酯(大于12个C)的脂肪酶(甘油酯水解酶，triacylglycerol acylhydrolases,Lipase，E.C.3.1.1.3),第3类脂解酶包括可以水解极性磷脂的磷脂酶(E.C.3.1.4.3)。国内外有关于二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）抗性酯酶，耐热嗜盐脂肪酶等的研究，但耐有机溶剂嗜盐酯酶的研究并未见国内文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株可以在发酵培养基中积累嗜盐酯酶的中度嗜盐菌株whb27。

本发明提供的菌株是从山东威海双岛盐场不同盐池的盐水和底泥中筛选得到的一种产新型嗜盐酯酶的中度嗜盐菌，该菌株为Halobacillus trueperi的一个新菌种，编号whb27。该中度嗜盐菌的分类名称为Halobacillus trueperi，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中国科学院微生物研究所），保藏日期为2013年5月20日，保藏编号为CGMCC No.7631。

本发明提供的中度嗜盐菌株whb27具有以下特征：菌落圆形，表面光滑，黄色；革兰氏染色阳性，镜检呈杆状，有芽孢；不能水解淀粉，分解葡萄糖产酸不产气，明胶液化试验、吲哚试验、触酶试验、V-P试验阳性，柠檬酸盐利用试验阴性；在1-15%NaCl、pH6.0-9.5、10～45℃之间都可生长，最适培养条件为盐度7%、pH7.5、28℃。具体生理生化特征见表1。

表1菌株whb27的生理生化特征

利用细菌通用引物PCR扩增菌株whb27的16S rDNA，得到该菌16SrDNA全序列1460bp，GenBank登录号为FJ444973。根据同源序列搜索的结果，与试验菌株一起用Clustal X软件进行匹配（align），用MEGA4.0软件进行分子系统学分析并生成系统进化树见图1。从系统进化树中可以看到whb27与Halobacillus trueperi XJSL8-7（GQ903456）被分在一个分支中，它们的16SrDNA序列同源性达到99%，结合上述生理生化分析，菌株whb27鉴定为Halobacillus trueperi。

本发明的另一目的是提供由上述嗜盐菌株whb27产生的新型嗜盐耐有机溶剂酯酶及其应用。

本发明提供的嗜盐酯酶通过如下方法得到：发酵嗜盐酯酶菌株whb27获得粗酶液，经过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、SephadexG-75凝胶柱层析得到分子量约35KDa的纯化酯酶蛋白，酯酶活性为32.8U/mg，比粗酶液提高了42倍。

该嗜盐酯酶的最佳活性条件为：pH8.0、2.5mol/L NaCl、42℃。