[发明专利]一种人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体来说涉及人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用。

背景技术

在转基因生物新品种培育重大专项和国家其他经费的资助下，我国转基因猪、牛和羊新品种研发获得了蓬勃发展，多个转基因动物品种展示了良好的产业化前景，其中发展最为迅速的是乳腺生物反应器的利用，目前转人α-乳清白蛋白基因奶牛已经通过了农业部规定的中间试验、环境释放及生产性试验。

由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府的高度重视。牛奶和奶制品是人们餐桌上最常见的一类食物，食品安全直接关系民生，在没有足够的数据证明其安全之前，质检机构均有责任和义务去检测和监测这些已上市或即将上市的转基因产品。开发一种实用、灵敏、特异的人α-乳清白蛋白成分检测试剂十分必要。

目前用于检测α-乳清白蛋白的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、放射性免疫法和酶联免疫吸附法等，但是检测人α-乳清白蛋白的报道却并不多。双抗体夹心ELISA又称抗原捕捉ELISA，该方法已被大量用于动物疫病的临床诊断，该方法最关键的条件是制备高纯度的包被抗体，纯度越高，则特异性越好，但尚无人α-乳清白蛋白转基因成分双抗体夹心ELISA检测方法的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明目的是提供一种人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒。

本发明另一目的是提供人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒检测人α-乳清白蛋白的方法。

本发明再一目的是提供人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人α-乳清白蛋白含量中的应用。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种人α-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人α-乳清白蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人α-乳清白蛋白单克隆抗体。

其中，所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO:7459的杂交瘤细胞株分泌获得。

杂交瘤细胞ZZY hLY7E1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC No.7459。

用原核表达重组蛋白hLA免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLA的1株细胞7E1。取杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。

细胞7E1能与免疫原hLA反应，不与筛选原牛α-乳清白蛋白（bLA）反应。Western Blot检测显示抗体7E1只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。

其中，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。

其中，所述人α-乳清白蛋白多克隆抗体是以人α-乳清白蛋白作为免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到。

纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为1mg/mL。采用间接ELISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到1∶200,000。

其中，检测样本中免疫抗原检测限为250ng/mL。

进一步地，所述人α-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种：

1）洗涤液；

2）底物显色液；

3）反应终止液；

4）人α-乳清白蛋白标准品。

更进一步地，所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H₂SO₄。

本发明还提供了前述试剂盒检测人α-乳清白蛋白的方法，包括如下步骤：

1）向包被人α-乳清白蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人α-乳清白蛋白抗原标准品和待检测样品，洗涤液洗板；

2）加入酶标人α-乳清白蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板；

3）加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，测定OD450值；

4）以人α-乳清白蛋白抗原标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人α-乳清白蛋白的含量。

本发明还提供了前述试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人α-乳清白蛋白含量中的应用。

具体包括以下步骤：

I IgG标准曲线的建立：