[发明专利]一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明属于超分辨显微领域，特别涉及一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法和装置。

背景技术

当普通的光学显微镜需要分辨两个或者更多点光源位置时难以突破衍射极限，其分辨率约为250nm，但当显微镜视野内仅有单个荧光分子时，通过高斯拟合单分子的点扩散函数可以很容易的突破常规光学显微镜分辨率的极限，实现超分辨显微。

基于单分子定位理论，Betzig于2006年提出了光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy,PALM)，同年底，美国的华裔科学家庄晓薇提出了一种类似PALM的方法并命名为随机光学重构显微术(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)。这两种光学超分辨技术都是利用荧光分子的光开关效应，首先采用一束特定波长的激活光使得同一时间只有极少数稀疏的荧光分子被激活，并具备发射荧光的能力，此时这些荧光分子所发出的荧光将不会由于衍射效应而发生空间上的串扰，再利用另一个波长的激光来观察、精确定位并漂白这些荧光分子，相应的荧光分子就可以被一一区分并通过PSF数字化的方法计算出中心位置，反复这一过程逐个获取数微米尺度范围内所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像，即可实现超分辨显微。

上述两种方法需对荧光分子进行稀疏的激活，以保证被激发的荧光不会由于衍射效应而发生空间上的串扰，同时要对最后获取的图像进行高斯拟合以确定荧光分子的中心位置。

发明内容

本发明提供了一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法和装置，装置结构简单，便于操作，能够实现基于荧光开关的快速超分辨显微成像，可用于光学显微成像领域。

一种基于荧光开关的快速超分辨显微方法，包括以下步骤：

1）将第一激光光束聚焦到荧光样品表面，对荧光样品进行激活；

2）将第二激光光束分为偏振方向互相垂直的第一线偏光和第二线偏光，再将所述的第一线偏光分为第一平行偏振光和第一垂直偏振光，同时所述的第二线偏光分为第二平行偏振光和第二垂直偏振光，然后将四束偏振光（指第一平行偏振光、第一垂直偏振光、第二平行偏振光和第二垂直偏振光）聚焦至荧光样品表面并发生干涉形成干涉光斑，所述干涉光斑中的亮斑部分对荧光样品进行漂白；

3）将第三激光光束聚焦到荧光样品表面，激发所述荧光样品中未被漂白的荧光分子发出荧光；

4）利用探测器收集所述荧光的信息，并通过计算机对该信息进行数据处理，完成对样品的扫描。

本发明中，在激活光对样品的荧光分子激活后，利用激光经两个渥拉斯顿棱镜形成两束垂直偏振光（s光）和两束平行偏振光（p光），这四束线偏光聚焦在样品上形成的干涉光斑对荧光样品进行漂白，再用激发光激发未被漂白的部分，也就是干涉光斑的暗斑部分并发出荧光，以实现快速超分辨显微，直接成像。

在所述的步骤2）中，所述的第二激光光束经第一渥拉斯顿棱镜分为第一线偏光和第二线偏光，第一线偏光和第二线偏光具有在振动方向和角度互相垂直的特性；

所述的第一线偏光经第二渥拉斯顿棱镜分为第一平行偏振光（p光）和第一垂直偏振光（s光）；

所述的第二线偏光经第二渥拉斯顿棱镜分为第二平行偏振光（p光）和第二垂直偏振光（s光）。

在所述步骤2）的干涉光斑中，相邻两亮斑或两暗斑中心的最小距离为D=λ/2NA，λ为波长，NA为聚焦用物镜的数值孔径。

在聚焦用物镜的入瞳处，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心连线垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的光斑中心连线。

将所述的荧光样品放置在纳米平移台上，并通过计算机控制纳米平移台在垂直光轴方向上移动，重复步骤1）～步骤4），完成对荧光样品的二维平面扫描。

本发明还提供了一种基于荧光开关的快速超分辨显微装置，包括：

第一激光器，用于发出激活荧光样品的激活光；

第二激光器，用于发出漂白荧光样品的漂白光；

第三激光器，用于发出激发未被漂白的荧光样品产生荧光的激发光；

沿所述第二激光器光路依次布置的双折射偏光器件、准直透镜、物镜和纳米平移台，所述的物镜用于将所述的激活光、漂白光和激发光聚焦于纳米平移台上的荧光样品；

用于收集所述荧光信息的探测器；

以及与所述探测器和纳米平移台连接的计算机。

所述的双折射偏光器件为依次布置的第一渥拉斯顿棱镜和第二渥拉斯顿棱镜；