[发明专利]血浆中肌苷含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别是涉及一种人体血浆中肌苷含量的测定方法。

背景技术

肌苷（Inosine），也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等。肌苷是人体的正常成分，为腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成。

研究证实：肌苷能活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，活化肝功能，并使处于低能缺氧状态下的组织细胞继续进行代谢，有助于受损肝细胞功能的恢复。并参与人体能量代谢与蛋白质合成。肌苷能提高ATP水平并可转变为各种核苷酸。可刺激体内产生抗体，还可提高肠道对铁的吸收，活化肝功能，加速肝细胞的修复。有增强白细胞增生的作用。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及定量下限的方法。

本发明的另一目的是提供一种测定人体血浆中肌苷含量的方法。

具体地说，本发明第一方面是提供了一种建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及定量下限的方法，它包括如下步骤：

（a）在人体空白血浆250ul中加入肌苷标准品溶液25ul，配制成至少五份不同浓度的肌苷血浆溶液，再分别加入0.1ug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合，得至少五份混合溶液；将所述混合溶液分别加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱液，再用1ml流动相溶液50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1洗脱，收集洗脱液，离心，取上清液；

（b）将经步骤（a）制得的上清液在下述条件下进行LC/MS/MS分析

质谱条件：

Compound（化合物参数）：

肌苷母子离子对：269.1/137.1，time:400msec

拉米夫定母子离子对：230.2/112.2，time:200msec

Duration：4min

Cycles：393

DP=26

CE=15

CXP=4

CEP=4

Q1resolution：Unit

Q2resolution：Unit，

Source/Gas（离子源/气参数）：

Ion Source：Turbo Spray

Curtain Gas（CUR）：10

Collision Gas（CAD）：Medium

Ion Spray Voltage（IS）：5000

Temperature（TEM）：700

Ion Source Gas1（Gas1）：60

Ion Source Gas2（Gas2）：10

Interface Heater（ihe）：ON，

液相色谱条件：

色谱柱：Waters XBridge^TM C18，规格：3.5um，2.1× 100mm，Part No.:186003022，S/N:01453030814045

流动相：50mM CH₃COONH₂:CH₃OH=1:1

流速：0.2ml/min

进样量：10ul

进样时间：4min；

（c）基于步骤（b）的分析结果，建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限。

在一优选例中，所述步骤（a）中还包括将所述混合溶液-70℃冻存的步骤。

在另一优选例中，所述不同浓度的肌苷血浆溶液为六份，其浓度分别为18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml和594.5ug/ml。

在另一优选例中，所述经活化的HLB固相萃取柱的活化步骤包括：使用VARIAN^TM VAC ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用1ml甲醇、1ml水进行洗脱活化。

在另一优选例中，所述步骤（c）包括：以待测人体血浆肌苷浓度（X，ug/ml）为横坐标，以待测人体血浆肌苷色谱峰面积（As）与内标色谱峰面积（Ai）的比值（Y=As/Ai）为纵坐标，进行线性回归运算，求得人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限。