[发明专利]一种西兰花离体细胞快速增殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种西兰花离体细胞快速增殖方法。

背景技术

西兰花（Brassica oleracea L. var italica Plenck）属十字花科芸墓属甘蓝种，为一、二年生草本植物。西兰花以顽强的生命力、不可替代的营养价值、药用价值、超乎食用价值被誉为“防癌、抗癌新秀”风靡世界。日本的农业研究院表示异硫代氰酸盐能阻止黑色素癌细胞的生长。其中，萝卜硫素是迄今为止蔬菜中发现的抗癌活力最强的一类异硫代氰酸盐，它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌、皮肤中得到充分的证明。近年来，从西兰花种子、不同器官中提取萝卜硫素的研究较广，但是从这些材料中提取萝卜硫素只能依赖于植物本身，严重受到成本高、含量低、季节、植物生长周期、土地资源等多因素的限制。解决这一问题的根本方法在于创造出一种西兰花离体细胞快速增殖方法。

然而，想达到快速增殖的目的，必须考虑西兰花品种、培养基、培养条件以及生长周期等内外因素，其中诱导和增殖培养基及其激素浓度配比的选择起着决定性作用，以至于对西兰花器官材料进行离体细胞诱导和快速增殖条件进行优化，找到最佳的诱导与增殖的培养环境，完成西兰花细胞的快速大量增殖方法的优化是非常必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种有效快捷的西兰花离体细胞快速增殖方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种西兰花离体细胞快速增殖方法，包括以下步骤：

⑴制备MS基本培养基：

首先在1000mL的烧杯中，将4.5 g~5.5g的琼脂加入温度为85~95℃的蒸馏水中，充分搅拌至所述琼脂至完全溶解，得到琼脂水溶液；然后在所述琼脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、铁盐母液20mL、钙盐母液20mL、镁盐母液20mL、有机母液20mL、肌醇母液20mL，充分搅拌后加入30g的蔗糖，搅拌至蔗糖完全溶解后用蒸馏水定容至1000mL刻度处，搅匀后，加入浓度为0.1mol/L NaOH或浓度为0.1mol/L HCl调节pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分装为一瓶，经121℃灭菌20min后室温下水平静置冷却4h，即得MS基本培养基；

⑵西兰花离体细胞获得及接种方法：

将当年西兰花种子用清水冲洗20~40min后，先用质量浓度为75%的酒精消毒0.25~0.75min，再用质量浓度为1% NaClO消毒2~6min，得到无菌种子；所述无菌种子用无菌水涮洗4~5次并接种于所述MS基本培养基上，在光照强度为4000~6000LX、温度为24~26℃条件下培养14d后得到无菌苗，其中每40~60mL所述MS基本培养基中接种5~8颗种子；切取长度为5mm的胚芽并以正面朝上接种到MS诱导培养基上，其中每40~60mL所述MS诱导培养基中接种4~6个胚芽，于黑暗、温度为24~26℃条件下脱分化培养30d即得西兰花离体细胞；

⑶西兰花离体细胞增殖方法：

将所述西兰花离体细胞接种于MS增殖培养基上，于黑暗、温度为24~26℃条件下培养15~20d即可，其中每40~60mL所述MS增殖培养基中接种4~6块且每块0.05~0.1g的所述西兰花离体细胞。

所述步骤⑵中的MS诱导培养基是指首先在1000mL的烧杯中，将4.5 g~5.5g的琼脂加入温度为85~95℃的蒸馏水中，充分搅拌至所述琼脂至完全溶解，得到琼脂水溶液；然后在所述琼脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、铁盐母液20mL、钙盐母液20mL、镁盐母液20mL、有机母液20mL、肌醇母液20mL，充分搅拌后加入30g的蔗糖，搅拌至蔗糖完全溶解，得MS基本培养基混合液；其次在所述MS基本培养基混合液添加2.0mg的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）与1.0mg的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），后用蒸馏水定容至1000mL刻度处，搅匀后，加入浓度为0.1mol/L NaOH或浓度为0.1mol/L HCl调节pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分装为一瓶，经121℃灭菌20min后室温下水平静置冷却4h即得。