[发明专利]分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶（EC 1.15.1.1）是催化超氧化物自由基阴离子反应形成过氧化氢和分子氧的酶，是生物体内重要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。它具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。超氧化物歧化酶在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。超氧化物歧化酶广泛应用于食品、化妆和医药领域，海洋来源的超氧化物歧化酶具有催化温度低、抗疲劳等特点。从海洋植物出发，获得超氧化物歧化酶是今后研究和开发这类酶的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分离简单、节约成本的分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法。

本发明所涉及的缘管浒苔是在中国江苏省连云港海域的海水中采集得到的，采集样本时间为2012年6月中旬。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，本发明是一种分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法，其特点是，其步骤如下：（1）样品处理：将采集的缘管浒苔先经过海水清洗去除泥沙和其他杂质，再用自来水和去离子分别清洗三次，挤干水；然后剪碎放入匀浆机中，并按1克浒苔加入3毫升50mM磷酸缓冲液、pH 7.4、含1 mM EDTA的比例，向匀浆机中加入4℃的50mM磷酸缓冲液，混匀并充分破碎浒苔细胞后将匀浆液置于4℃温度下冷藏2 h，然后取出过滤，取滤液在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液；

（2）硫酸铵盐析：向上述上清液中先加入硫酸铵至50%饱和度，在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液继续加入硫酸铵至70% 饱和度, 在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，将沉淀物用10 mM、 pH7.4的磷酸缓冲液溶解并透析得酶液；

（3）离子交换层析：将上述酶液装入层析柱中，层析柱选用GE healthcare的Q-sepharose FF阴离子交换层析填料，安装到Bio-Rad双流相快速蛋白层析仪上，柱床先用10 mM 、pH7.4的磷酸缓冲液溶平衡，设置程序分别进样，样品的线性洗脱和层析柱再生，线性洗脱溶液的浓度为800 mM氯化钠，流速0.8 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液合并和超滤浓缩，进行凝胶过滤层析；

（4）凝胶过滤层析：将上述洗脱液按程序进入GE healthcare的Superdex 200 10/30 GL层析柱，洗脱液为10 mM、 pH7.4，含150 mM 氯化钠的磷酸缓冲液，洗脱流速控制为0.3 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液进行透析并冷冻干燥得到缘管浒苔铁超氧化物歧化酶。

本发明方法简单合理，具有良好的可操作性，并且成本低，应用该方法将缘管浒苔铁超氧化物歧化酶纯化了103.6倍，回收率为19.1%，最终酶的比活力达1750 U/mg蛋白。

附图说明

图1离子交换层析色谱图。

图2凝胶过滤层析色谱图。

图3 SDS聚丙稀铣胺凝胶电泳， 泳道1是缘管浒苔超氧化物歧化酶，泳道2是Marker。

图4 凝胶过滤层析测量酶的分子质量。

图5 抑制剂法检测超氧化物歧化酶的类型。泳道1：酶经去离子水处理，泳道2：酶经5 mM氰化钾处理，泳道3：酶经5 mM过氧化氢处理，泳道4：酶经5 mM SDS处理。

图6 酶的催化温度曲线和热稳定性。■表示催化温度，●表示热稳定性。

图7 酶的pH稳定性图。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。