[发明专利]基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用

说明书

技术领域

本发明涉及电致化学发光领域，尤其涉及一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用。

背景技术

石墨烯是一种二维自由态原子晶体，它是构筑维富勒烯、一维碳纳米管、三维体相石墨等sp²杂化碳的基本结构单元，自2004年首次报道以来，引起了国内外研究者们的极大关注。石墨烯优良的电化学、力学和热力学性质，使得其广泛应用于聚合物材料、传感器、与能量相关的材料和场效应晶体管等研究。然而，石墨烯是一种零带隙材料，很难观察到其发光现象。因此，运用各种方式处理石墨烯的带隙并拓展其发光应用，引起了科学家极大的研究兴趣，如，通过掺杂打开石墨烯的带隙，通过部分还原和表面钝化利用氧化石墨烯(GO)，将石墨烯材料腐蚀切割成石墨烯量子点(GQDs)以诱导其光致发光(PL)等。尤其是新发现的GQDs，为电致化学发光(ECL)研究和应用提供了良好材料。然而，迄今为止，GQDs在ECL方面的研究应用非常少。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用，它制备的传感器具有检测灵敏、选择性好和稳定性好的优点。

本发明是这样来实现的，一种基于氧化石墨烯和石墨烯量子点之间电致化学发光能量转移（ECL-RET）作用的传感器制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：

（1）采用Hummers方法制备GO：将1.0 g石墨和1.0 g NaNO₃加入到46 mL的质量百分浓度为98%的H₂SO₄中，冰浴下缓慢加入6.0 g KMnO₄，于35 °C水浴中搅拌1 h，加入80 mL超纯水，继续搅拌30 min，再加入200 mL超纯水后，逐滴加入6 mL的质量百分浓度为30%的H₂O₂，室温下反应1 h；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，将产物分散到500 mL超纯水中，超声处理2 h，即制得均匀分散的GO；

（2）利用水热法制备GQDs：将干燥的GO置于管式炉中，在N₂保护的条件下，以5 °C/min的升温速率加热到200 °C并保持2 h，得到石墨烯片；将0.05 g石墨烯片加入到体积比为1:3的浓硫酸:浓硝酸的混合溶液中超声17 h，加入250 mL超纯水稀释；用0.22 μm微孔滤膜过滤，将收集的滤饼悬浮在40 mL超纯水中，用NaOH调节溶液pH为8后，转移入反应釜中于200 °C反应12 h，冷却到室温；用0.22 μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为GQDs溶液；所述的浓硫酸的质量百分浓度为98%，浓硝酸的质量百分浓度为68%；

（3）羧基化GQDs的制备：将0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸钠加入到20 mL的GQDs溶液中，超声反应3 h，用盐酸调节溶液pH为中性，即得到羧基化的GQDs；

（4）抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯（Ab-GO）复合物的制备：将200 μL、1 mg/mL的GO和200 μL、5 μg/mL的抗磷酸化丝氨酸抗体（Ab）混合，室温条件下反应12 h；将产物在10000 rpm下离心30 min，用超纯水清洗3次，将产物重悬于10 mM、pH 7.4的磷酸盐（PBS）缓冲溶液中，4 oC下保存；

（5）ECL传感器的制备：玻碳电极先在粒径为1.0，0.3，0.05 μm的α-Al₂O₃糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1 min。将10 μL、质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干后，将电极浸入到含有5 mM的N-乙基-N’-1-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的羧基化GQDs溶液中，室温下孵化5 h；用10 mM、pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗后，将电极插入到含有5 mM的EDC、8 mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50 μM的多肽溶液中反应3 h；再将电极插入到含有蛋白激酶（CK2）和三磷酸腺苷（ATP）的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris）缓冲溶液中反应2 h，使多肽发生磷酸化；将磷酸化多肽修饰电极在Ab-GO复合物溶液中孵化1 h，即制得ECL传感器；上述步骤中，所述的壳聚糖溶液的配制方法为将壳聚糖加入到质量百分比为1%的醋酸溶液中并超声溶解。所述的Tris缓冲溶液的浓度为20 mM，pH为7.4，包含20 mM的MgCl₂。