[发明专利]一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种扩增脐带血造血干细胞的蛋白及其培养基。

背景技术

造血干细胞在治疗白血病、恶性肿瘤、重症非恶性血液系统疾病以及某些遗传性疾病中有广泛的应用，是因为这类细胞具有自我更新、高度繁殖、向多个方向分化等能力，这也意味着造血干细胞在临床治疗恶性血液疾病上具有巨大应用价值。

目前，用以移植的造血干细胞主要有三种来源：骨髓，外周血和脐带血。骨髓和外周血是目前广泛应用的造血干细胞移植来源，但是存在配型困难，采集过程会给供者带来痛苦等问题。脐血移植在一定程度上避免了这些问题。但是对于成人而言，单份脐血的造血干细胞不够患者使用并且脐血造血干细胞相对于成体骨髓和外周血造血干细胞处于更加幼稚阶段，移植后病人造血功能恢复缓慢，增加了移植后病人的痛苦。因此体外扩增脐带血造血干细胞则是最有希望解决上述瓶颈的途径之一。

当前，进行体外扩增脐带血造血干细胞的主要方法是通过加入不同细胞因子组合（如干细胞生长因子-SCF、多效生长因子-PTN、Fms样酪氨酸激酶-3配体-FLT3L和血小板生成素-TPO）刺激脐带血造血干细胞的增殖。但是扩增得到的造血干细胞却在很大程度上失去了干细胞的特性或是自我更新的能力减弱或是向下游血液细胞分化的潜能丢失。

发明内容

为解决现有技术中脐血造血干细胞体外扩增倍数不高、不能维持干细胞特性的缺陷，本发明发现公开了一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基，实现显著提高脐带血造血干细胞的扩增倍数，维持干细胞特性的目的。

实现上述目的采用的技术方案为，本发明开发出了一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤，（1）从胎龄为11天的小鼠胎肝中分离出胎肝基质细胞；胎肝是哺乳动物个体发育过程中活力最强的造血器官，胎肝里面含有支持造血干细胞增殖的基质细胞；胎肝基质细胞在体外培养会贴壁生长；

（2）经步骤（1）分离出来的胎肝基质细胞，用SV40大T抗原转化这些原代基质细胞后连续传代30次以上得到永生化基质细胞；

(3)将（2）步建立的永生化基质细胞，分别挑取单个的基质细胞100个并分别扩大培养，得到20株永生细胞；筛选出的细胞株在培养液中很好的传代，得到细胞系，进一步将这些细胞系分别与脐带血造血干细胞共培养，发现其中一株细胞对造血干细胞有增殖的作用且可维持干细胞特性；

（4）将（3）步筛选出的细胞做基因芯片分析，发现5’-TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在该细胞内高表达;在美国国立生物信息中心数据库中搜索出该片段只位于ANGPTL7基因内；我们可以构建出该基因序列，精确的保证了应用其序列形成的细胞因子对脐带血造血干细胞的增殖作用；

(5)将（4）筛选到基因的cDNA连同一段编码六个组氨酸的核苷酸序列5’-CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能够把目的基因导入到基因组中的PB载体中，然后通过脂质体转染的方法将该载体与另一个含有编码PB酶的辅助载体一起转染293T细胞得到能够过表达目的基因的293T细胞;

（6）将（5）构建好的能表达目的蛋白ANGPTL7的293T细胞扩大培养,利用镍离子亲和纯化的方法纯化出目的蛋白；

(7)将(6)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中培养脐带血造血干细胞最终验证ANGPTL7促进脐带血造血干细胞的体外增殖同时维持造血干细胞特性的功能。

所述步骤（3）中将（2）步筛选出的胎肝细胞培养增殖所使用的培养基为含有质量浓度分别为10%血清、1%双抗的α-MEM培养基。利用此培养基可以很好进行细胞传代、扩增并建立细胞系。

本发明还公开了包括上述细胞因子的培养基，该培养基为StemSpan培养基，培养基包括50-100ng/ml的SCF,20-50ng/ml TPO,50-100ng/ml FLT3L,50-100ng/ml PTN，

上述的培养基还包括200ng/ml-2ug/ml ANGPTL7蛋白。利用该培养基可以有效促进脐带血造血干细胞增殖，同时保持造血干细胞的特性。