[发明专利]一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法

权利要求书

1.一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：第一步(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）在含有重组卤醇脱卤酶HHDH的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，第二步(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在重组腈水解酶NIT的催化下生成(R)-3-羟基戊二酸乙酯，所述的两个反应步骤均在反应罐中的水溶液中催化反应；

所述的制备方法为：

1）以(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯为底物加入含氰化钠水溶液的反应罐1中，接着加入重组卤醇脱卤酶进行催化反应；重组卤醇脱卤酶的用量为底物质量的2％～15％w/w，氰化钠的用量为底物质量的5％～20％w/w；所述反应在pH为6.0～8.0 的水相中进行，反应体系的温度为40～55℃；当通过气相色谱法测得混合液体中的底物转化率大于95%时，开始通过添加管路流加底物(S)-CHBE和卤醇脱卤酶液，同时打开两个反应罐间的流量调节阀，保持反应罐1中的反应体积不变；

2）在反应罐2中起始加入腈水解酶缓冲液到最低搅拌叶处，调节反应温度至25～30℃，当从反应罐1中开始流出含中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的反应液时，同时向反应罐2中加入腈水解酶粗酶液；腈水解酶粗酶液的用量为底物质量的20% ～60%；收集反应罐2产物出口管流出的反应液，调节反应液pH至2.0，硅藻土过滤除酶，等体积乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，无水硫酸钠除水，旋蒸，即得产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法的制备装置包括反应罐1和反应罐2，反应罐中设有搅拌装置，反应罐1和反应罐2通过带有流量调节阀的管路相连接，反应罐1上设有底物添加管路，pH控制管路和重组卤醇脱卤酶添加管路，反应罐2上设有重组腈水解酶添加管路和产物出口管。

3.根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述从反应罐1流向反应罐2的速率为反应体系流加速率，所述反应罐1中底物流加速率、卤醇脱卤酶液、氰化钠溶液流加速率三者之和等于反应体系流加速率。

4.根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述反应罐1中的氰化钠溶液通过磷酸调节反应体系的pH值；反应罐1中优选的pH为6.8～7.2，反应温度为48～50℃。

5.根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，反应罐1中底物的流加速率为反应体系流加速率的1%～5%，卤醇脱卤酶液的流加速率为反应体系流加速率的5%～25%；反应罐2中腈水解酶粗酶液的流加速率为反应体系流加速率的0.5％～2％。

6.根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶液按粗酶液：去离子水=1：60的比例配制。

7.根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的制备方法为：将含有重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT基因的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度1mM，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2～8倍体积的三乙醇胺缓冲液2mM，pH7.0悬浮细胞；细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟；4℃下15000g离心30min，取上清液，得重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的粗酶液。