[发明专利]改进无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体筛选领域，特别涉及利用链霉亲和素标记的琼脂糖颗粒固定寡核苷酸文库，并通过SELEX技术筛选出青霉素类抗生素适配体。

背景技术

适配体(aptamer，或核酸适配体)是一小段经过SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，即指数富集配体的系统进化技术)体外筛选得到的寡核苷酸链。Aptamer一词来源于拉丁文的―aptus‖，意思为配对适应。它可以折叠成明确三维结构的、通过空间构型互补与靶分子高亲和性高特异性结合。1990年，Ellington和Szostak在《Nature》上首次报道了这种大容量随机单链寡核苷酸文库通过筛选、扩增的技术，筛选到能够特异性结合于染料小分子的RNA适配体；Tuerk和Gold在《Science》上报道了筛选出了T4DNA聚合酶；Robertson和Joyce则体外筛选出了Ⅰ型核酶，这三个课题组推动了SELEX技术的快速发展。SELEX技术的基本原理就是利用分子生物学技术，首先构建一个人工合成的单链随机寡核苷酸文库，这个文库中的每一条随机寡核苷酸，其随机区的每个核苷酸位置都存在4种可能性，如果随机区有n个核苷酸，那么随机序列的多样性就有n⁴种，再加上稀有碱基或人为修饰碱基，随机序列的多样性会更多。一般随机区域的长度为30个核苷酸左右，库容量便可达到10¹⁴～10¹⁵个单链寡核苷酸序列之间。文库的中间为随机序列，序列长度往往在20～40bp之间。随机序列两端是带有限制性内切酶位点的固定序列，此固定序列是多聚酶链反应及其他酶学反应相关引物的结合位点。在随机文库中，单链随机寡核苷酸不同分子有其独特一级序列，易形成多种三维空间立体结构，几乎能与自然界所有存在的种类分子作用。用它与靶物质混合,混合液中存在靶物质—核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子,以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA或RNA分子被洗去，而与靶物质高有亲和力的DNA分子或RNA分子从中被分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，经数十轮后克隆测序后筛选得到适配体。

SELEX过程中的关键步骤是将未结合的核酸与能与靶物质结合的核酸分开。大多数研究者选择将靶物质固定，当单链寡核苷酸库与靶物质混合，能与靶物质结合的核酸分子随着靶物质一起留在固定介质上后，洗去不能结合的核酸。通过固定靶物质的方法，人们运用SELEX技术已成功筛选到包括有机染料、药物、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、氨基类似物、核苷酸和多肽等物质的适配体，青霉素类抗生素适配体的筛选少见报道。但运用该方法的前提是靶物质有固定点，而有些靶物质由于分子量过小等原因无法进行固定，因此开发一种无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体的筛选方法是十分有必要的。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103114147A，公开日2013-05-22，公开了一种分析化学核酸适配体筛选技术领域的无固定点靶物质的适配体筛选方法，该技术通过构建随机寡核苷酸文库以及用于PCR扩增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文库引物，并利用链霉亲和素标记的琼脂糖颗粒固定寡核苷酸文库，最终通过SELEX方法筛选得到可用于克隆测序的PCR产物，经测序后得到与无固定点靶物质特异亲和性结合的适配体。将该方法应用于重金属镉离子适配体的筛选，得到13条能与镉离子高特异性、强亲和力作用的适配体。本发明固定效果好、适用性强且成本低，可用于无固定点靶物质的适配体筛选。但该技术在洗脱与靶物质镉离子亲和力弱的核酸后，需要在固定了镉离子的ssDNA液中加入抑制剂，以去除重金属镉离子，防止镉离子对下一部PCR扩增的干扰作用。此过程可能会造成与镉离子亲和力高的ssDNA丢失或带入其他物质。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种改进无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体及其应用，通过固定寡核苷酸文库，洗脱未固定的核酸，正向筛选时加入青霉素类抗生素的母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）与固定的核酸作用，洗脱下能与6-APA结合的核酸分子后，直接PCR扩增后用于下一轮筛选；负向筛选时加入其他抗生素，洗脱除去与青霉素类抗生素非特异性结合的核酸分子。经过多轮次的正、负筛选，得到10条与6-APA高特异性、强亲和力作用的核酸适配体。