[发明专利]桑树病程相关基因非表达子基因NPR1的克隆及应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种桑树病程相关基因非表达子基因NPR1的克隆及应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

桑树在长期的进化过程中常常受到一些病原微生物的侵袭,由于桑蚕对农药敏感，常规的农药难以在桑园施用，桑树病害往往造成桑叶产量和质量的降低，是影响蚕桑业发展的重要因素。开发广谱抗病新资源，培育持久抗病新品种是解决这一问题的根本途径之一。因此，利用植物本身编码的抗病基因，通过基因工程技术培育抗病新品种是解决这一问题的根本途径。植物在长期进化过程中，形成了复杂的防御病原物侵染的抗性机制，这一机制由不同水平的多个抗性途径交叉、重叠组成，使得植物抗病性具有多种表现形式。不同形式的抗病性信号传导途径有区别，也有重叠和交叉。其中的交叉点将是调节植物整体抗病性的重要因子。近年来的研究结果表明，NPR1不仅对系统获得性抗性和诱导系统抗性起核心调控作用，而且也是基础抗性以及由抗病基因决定的抗性的重要调控因子，是植物抗病性的关键调节基因。通过基因工程技术将NPR1应用于桑树育种，可以使桑树避免多种病害的发生，具有光明的应有前景。但关于桑树NPR1基因的克隆及其在桑树抗病性中的作用，目前还未见报道。

三、发明内容

本发明的目的旨在提供一种可提高桑树抗病性的相关基因NPR1，同时提供一种该基因在植物中应用的方法，可提高植物的抗病能力。

本发明中提供的核苷酸序列来自桑树。

本发明从桑树（Morus alba var.multicaulis）叶片中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据GenBank中已发布的其他植物NPR1基因编码蛋白的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析。然后通过3′和5′末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术分别获得3′和5′端序列。根据cDNA的3′和5′末端序列设计特异引物，以桑树的cDNA为模板进行PCR扩增，得到桑树NPR1的cDNA全长序列，其基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

桑树NPR1基因开放阅读框全长1743bp。由此推演出该基因编码的蛋白具有580个氨基酸，将蛋白质序列在GenBank中检索，发现与已发表的ViNPR1（葡萄，XM002281439）、CaNPR1（辣椒，DQ648785）、NPR1（番茄，NM001247629），NiNPR1（烟草，AF480488）等相比，蛋白质同源性分别为72.35%、69.40%、68.38%，68.31%。由此表明，我们成功分离得到了桑树NPR1基因的全长cDNA。

桑树NPR1基因序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO.1的信息

(a)序列特征

长度：1743bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：桑树（Morus alba var.multicaulis）

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1

atggattcca aaaccggctt ttccgattcc aacgagatcc tgagcaacag caacagcagc     60

atatgctgca tgggccaaaa actgccctcg tcgtcggaga attcaccgcc gtcggatgtc    120

tcggccctaa accggctctc ggagaatctc cggtcggcct tcaattcccc ggagttcgac    180

ttcttagctg acgcgaggct cgtcgtgagc ggcggccggg aggtccccgt ccaccggtgc    240

attctggcgg caagaagcgg attcttccgg aacatgttct gcagatcgcg ggagaagggt    300