[发明专利]氟甲喹快速检测试纸卡及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测氟甲喹的器具，特别是涉及一种快速检测氟甲喹的试纸卡及制备方法。

技术背景

氟甲喹是氟喹诺酮类抗生素，具有抗菌普广、杀菌活性强、体内分布广泛等等特点，并且与其他抗菌药物无交叉耐药性。目前，广泛应用于畜禽和水产养殖中。氟甲喹作为用于食品类动物中的药物，其在动物可食性组织和产品中的残留致癌毒性备受关注。国家对其在不同肉品中最高残留量做了严格的规定。因为氟甲喹价格低廉，抗菌普广、杀菌活性强，养殖户盲目追求预防和治疗效果，人为超量添加，造成在肉品中残留超标的现象普遍存在。因此,精确检测肉品中氟甲喹残留量非常重要。

目前，测定氟甲喹的方法多为高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用、毛细管区带电泳与质谱联用、酶联免疫试剂盒等法。这些方法检测时间一般较长，检测不方便，检测成本高，对检测人员素质要求高，严重制约了在实际检测中的应用，难以推广。由于这些方法的局限性和严重滞后性，使监控氟甲喹的非法使用变得困难，无法保证食品安全监控的有效性。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种特异强、灵敏度高，能快速、简便地检测氟甲喹的试纸卡及制备方法。

本发明的技术方案是：

一种氟甲喹快速检测试纸卡，含有外壳和位于外壳内的试纸芯，试纸芯包括底板，底板上依次固定黏贴有样品垫、胶体金标记垫、检测反应区和吸水垫，所述胶体金标记垫吸附有氟甲喹的特异性抗体，所述检测反应区设有氟甲喹偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹；所述氟甲喹特异性抗体为胶体金标记的氟甲喹单克隆抗体或多克隆抗体。

所述氟甲喹偶联载体蛋白溶液是由以下方法制备的：

称取2 mg 氟甲喹溶解于500 μL 的DMF溶剂中，加入2 mg NHS和2 mg EDC，室温避光反应24h，得到活化的氟甲喹液；称取载体蛋白2 mg，充分溶解于2 ml 0.13 的mol/L 的PBS溶液中，将活化的氟甲喹液逐滴加入载体蛋白溶液中，密封避光于室温下搅拌4h；将反应产物置于4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS透析3天，离心除去沉淀，得到氟甲喹载体蛋白的偶联物，分装，-20℃保存，备用。

所述氟甲喹偶联载体蛋白为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、卵血清白蛋白或血蓝蛋白。

所述底板由硬质塑胶条或不吸水的硬纸条制成；所述样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述吸水垫用吸水滤纸或滤油纸制成；所述检测反应区用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；所述胶体金标记垫用玻璃纤维、聚酯膜、醋酸纤维或尼龙膜制成。

所述外壳由底座和面板构成，底座和面板通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面板上设有检测窗、加样孔，检测窗与试纸芯的检测反应区相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。

所述隐形检测印迹和隐形对照印迹的排列方式为“︱︱”、“＋＋”或“··”。

所述氟甲喹快速检测试纸卡的制备方法，包括以下步骤： 

（1）氟甲喹与载体蛋白的偶联：

称取2 mg 氟甲喹溶解于500 μL 的DMF溶剂中，加入2 mg NHS和2 mg EDC，室温避光反应24h，得到活化的氟甲喹液；称取载体蛋白2 mg，充分溶解于2 ml 0.13 的mol/L 的PBS溶液中，将活化的氟甲喹液逐滴加入载体蛋白溶液中，密封避光于室温下搅拌4h；将反应产物置于4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS透析3天，离心除去沉淀，得到氟甲喹载体蛋白的偶联物，分装，-20℃保存，备用；

（2）抗氟甲喹特异性抗体的制备；

（3）氟甲喹特异性抗体的制备；

在沸腾的200mL 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1％柠檬酸钠8mL，获得直径为10-20nm的胶体金溶液，用0.1mol/L 的K₂CO₃调pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存，备用；以1：2000的标记比将待标记的氟甲喹单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后加入20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的胶体金标记物蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得氟甲喹胶体金标记抗体；