[发明专利]基于柱矢量光束的受激发射损耗显微成像方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及受激发射损耗显微成像技术，具体涉及一种利用柱矢量 光束的超分辨受激发射损耗显微成像方法及装置。

背景技术

现代生物学和材料科学的发展对微观结构的研究提出了越来越高的 分辨率需求，希望从分子水平揭示生命过程和材料性能的物理本质。但 受到光学衍射极限的限制，普通光学显微镜的横向分辨率一般只能达到 200nm，纵向分辨率约500nm，这对于研究亚细胞结构和分子结构已无能 为力。虽然电子显微镜（ElectronMicroscopy）、原子力显微镜（Atom ForceMicroscopy）、近场扫描光学显微镜（Near-fieldScanningOptical Microscope,NSOM）等技术可以获得很高的分辨率，但是由于缺乏特异 性的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子，而且也不适合观察活细胞 和细胞膜的动态变化过程。因此，如何利用光学方法突破传统光学显微 镜的分辨率极限，使其既具有纳米尺度的光学分辨本领又可以连续监测 生物大分子和细胞器微小结构的演化，成为光学显微成像技术的一个重 要挑战和机遇。

近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，远场光 学显微成像的分辨率已经突破了衍射极限的限制，发展了多种超分辨荧 光显微成像技术，如激活定位显微技术（PhotoactivatedLocalization Microscopy,PALM）、随机光学重构显微技术（StochasticOptical ReconstructionMicroscopy,STORM）、受激发射损耗显微技术 （StimulatedEmissionDepletion,STED）和结构照明显微技术 （StructuredIlluminationMicroscopy,SIM）等。其中，STED显微成 像技术受到了特别关注，基于该技术极大改进了远场光学显微成像的分 辨率，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质，而且它是一种从物理上 打破衍射光学极限的远场荧光显微技术。STED显微成像技术的原理是： 首先，使用一束激光在样品表面聚焦产生一个实心小光斑，仅激发一个 点的荧光基团使其发荧光；然后，再用另一束激光在样品表面相同位置 区域聚焦产生一个面包圈样的空心光斑抑制那个点周围的荧光强度，这 样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到。接下来，收集发 光点发出的荧光，探测处理后得到超分辨的显微图像。最后，连续移动 三维平移台改变探测位置，最终得到整个物体的三维显微成像。

实现超分辨STED显微成像的关键是如何形成具有超小尺寸的激发 光斑和抑制光斑，其中激发光斑是一个聚焦的实心光斑，而抑制光斑是 一个聚焦的空心光斑。STED显微镜的分辨率主要是由有效荧光光斑的大 小及损耗效果决定的。可以通过各种措施改善STED光在焦平面相干形成 的抑制光斑的干涉对比度及中心强度分布,通过改善影响相干的条件, 压缩荧光光斑的大小,尽可能提高横向和轴向抑制比。

近年来，提出了多种实现激发光斑和抑制光斑的方法和实验装置， 例如SWHell等人提出了一种基于0～2π涡旋位相板，使用圆偏光形 成面包圈样的空心聚焦光斑的方法，见文献“SWHell.Far-field opticalnanoscopy,SingleMoleculeSpectroscopyinChemistry, PhysicsandBiology.SpringerSeriesinChemicalPhysics96: 365-398，2010”。作为一种经典的光斑形成方法，它被广泛应用于目前 的多种STED显微镜产品中。但这种技术的缺点在于圆偏振激发光难以聚 焦到衍射极限以下，另外如果利用圆偏振光通过涡旋位相板形成面包圈 光斑来抑制激发光斑周围的荧光，其抑制效果的提高只能靠增加STED激 光功率，而高光强会对生物样品造成损伤。随后，又提出了诸如基于0/π 圆形相位板、切向偏振涡旋光束等获得抑制光斑的方法。

如何通过对激发光束和受激发射损耗光束进行合理的偏振、相位及 振幅调制以获得满足要求的超小聚焦光斑，这成为目前STED显微成像技 术一个重要的技术关键。

发明内容

本发明提出了一种基于柱矢量光束的超分辨STED显微成像方法及 装置，利用该方法可获得物体的三维超分辨显微成像。