[发明专利]一种重组人血小板衍生生长因子BB的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种重组人血小板衍生生长因子BB的纯化方法。

背景技术

血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质，是低分子量促细胞分裂素，能刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等多种细胞进入分裂增殖周期。血小板衍生生长因子PDGF于1974年发现的一种刺激结缔组织等组织细胞增长的肽类调节因子，因其来源于血小板而得名，正常生理状态下存在于血小板的α颗粒内，当血液凝固时由崩解的血小板释放出来并且被激活，具有刺激特定细胞趋化与促进特定细胞生长的生物活性。此外，在组织受到损伤时巨噬细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、胚胎干细胞等也可以合成并释放PDGF。肝脏受损时，巨噬细胞、血小板、浸润的炎细胞、受损的内皮细胞及激活的肝星形细胞均可以分泌PDGF，以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。

PDGF家族包括A、B、C、D4种不同的多肽链，通过二硫键形成纯合或杂合二聚体，组成5种亚型：PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PDGF-CC及PDGF-DD，其中具有生物活性的均为纯合二聚体形式，而PDGF-BB与心血管疾病的关系最为密切，相关研究较多。

PDGF对起源于间叶的细胞包括成骨细胞具有丝裂原作用，既能促进成骨细胞增殖和复制，又能刺激骨吸收，起双向调节作用，维持成骨细胞-破骨细胞之间的功能性平衡，对于骨的重建过程有重要调节作用。有研究表明PDGF与创伤修复关系密切，能直接或间接地参与创伤修复过程中的炎症反应、组织和细胞分化与增殖过程，特别是对一些慢性难愈性伤口如糖尿病溃疡等有明显的促愈合作用。研究表明在PDGF所有亚型中，PDGF-BB促进创伤愈合及骨组织修复、重建的作用最为肯定。

目前，生产PDGF主要方式为：通过转基因建立工程菌的方式利用中国仓鼠卵巢细胞、大肠杆菌以及毕赤酵母来发酵生产。目前利用中国仓鼠卵巢细胞生产PDGF的方法虽然能生产成熟的PDGF-BB胞外产物，但其方法还不成熟，存在发酵条件要求较高，发酵成本高，且产量低等缺点。而大肠杆菌生产的PDGF-BB为包涵体形式的未成熟的胞内产物，在下游纯化过程中还要进行菌体破碎、包涵体洗涤、变性、复性等工作，存在纯化步骤繁琐、纯化成本较高等缺点。而毕赤酵母能生产成熟的PDGF-BB胞外产物，其方法成熟，能进行高密度发酵生产，具有成本低、产量高等优点。如“人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体的构建”（杨春露等，第一军医大学学报，2004,24（3））、“毕赤酵母高效表达血小板源生长因子研究”（李培旺等，生命科学研究，2005，9（4））等文献中详细描述了用毕赤酵母制备PDGF-BB的方法，但后续毕赤酵母制备的PDGF-BB如何进行纯化并没有做详细的研究。鉴于毕赤酵母高密度发酵制备的PDGF-BB发酵液中，杂质较多，特别是色素，核酸和内毒素等产物的存在，造成纯化困难，成本高昂。为此，需要找出一种易于放大，适合大生产的纯化路线及其纯化方法，以解决实验室到生产阶段的放大过程中的瓶颈，为生产工艺的落地做好铺垫，为此本发明经过研究，找到了一种易于放大，纯化效率高的纯化方法。

在本发明中，其主要的纯化步骤及作用为：离心去除菌体以及可见颗粒物，超滤浓缩，阴离子交换层析去除发酵液中带负电荷的DNA、色素、内毒素以及部分宿主细胞蛋白，阳离子交换层析获目的蛋白，凝胶层析进行精纯以去除痕量的杂质，从而可以得到符合制剂要求的目的蛋白。与现有技术中的发酵液稀释法相比，本发明的方法节省了大量的注射用水及其缓冲液的配制，缩短了纯化的时间。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种重组人血小板衍生生长因子BB的纯化方法，纯化目的是将PDGF-BB从用毕赤酵母作为表达载体经过培养分离得到的含有PDGF-BB成分的发酵培养液中分离出来，其中，用毕赤酵母作为表达载体经过培养分离得到的含有PDGF-BB成分的发酵培养液的生产过程属于现有技术的范畴。

本发明的纯化方法，主要包括以下步骤：

（1）发酵液预处理：发酵液离心取上清，上清液通过膜浓缩、洗滤，然后离心取上清液；

（2）阴离子交换层析：洗滤好的上清液通过阴离子交换层析色谱柱上样，接收透过液，然后通过稀释缓冲液对其稀释；

（3）阳离子交换层析：通过阳离子交换层析色谱柱对稀释液进行捕获，洗脱缓冲液进行洗脱，得到洗脱液；

（4）凝胶色谱层析：洗脱液经凝胶色谱柱纯化，即可得高纯度PDGF-BB。