[发明专利]四环素适配体与检测四环素的适配体电化学生物传感器

权利要求书

1.一种四环素适配体，其特征在于，所述适配体为含有TTGAGCCCT序列、长度为13-20bp的单链DNA探针，且5’端修饰了氨基即5’-NH₂-(CH₂)₆-。

2.一种检测四环素的适配体电化学生物传感器，其特征在于：所述的电化学生物传感器中含有如权利要求1所述的适配体。

3.如权利要求2所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用超纯水超声清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液于20-25℃下活化10分钟，得到活化的裸金电极；

（2）活化电极的适配体修饰：合成如权利要求1所述的适配体，配制100μmol/L的适配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L适配体组装液；将步骤（1）所得的活化的裸金电极浸入适配体组装液中，密封4℃下组装24小时，得到所述的适配体电化学生物传感器。

4.根据权利要求3所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中采用的Piranha溶液中，浓硫酸与30%H₂O₂的体积比是7:3。

5.根据权利要求2所述的适配体电化学生物传感器用于检测四环素的用途。

6.一种基于如权利要求2所述的适配体电化学生物传感器的检测四环素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对四环素标准溶液进行检测，建立标准曲线：

将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl（饱和KCl）电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；

将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的含0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0；

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度1.0ng/mL的四环素水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的四环素，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的含0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到浓度为1.0ng/mL的四环素标准液的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret1；

同理，将上述修饰电极依次放入浓度5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×10²ng/mL、5.0×10²ng/mL、1.0×10³ng/mL、5.0×10³ng/mL的四环素标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗分析，记录其对应的交流阻抗图谱及阻抗值Retn（n=2,3…8），并计算各标准液相对初始的适配体电化学生物传感器的阻抗变化值△Ret即各标准液对应的阻抗值Retn（n=1,2,3…8）减去适配体电化学生物传感器对应的阻抗值Ret0；

以浓度为1.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×10²ng/mL、1.0×10³ng/mL、5.0×10³ng/mL的四环素标准液浓度的对数为横坐标，以这8种标准液对应的阻抗变化值△Ret为纵坐标作图，建立标准曲线；

（2）对含四环素的样品溶液进行定量检测：

根据GB/T21317-2007所述方法对样品中的四环素进行提取纯化；将得到的四环素干粉用超纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测；

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入从样品溶液中提取纯化得到的四环素水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的，含浓度0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到样品中四环素溶液检测的交流阻抗图谱及其阻抗值Rets；

通过步骤（1）建立的标准曲线，计算出Rets-Ret0对应的四环素浓度，即为样品中四环素的浓度。