[发明专利]稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系及其在制备猪瘟疫苗与诊断试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系及其在制备猪瘟疫苗与诊断试剂中的应用。更具体地，本发明涉及一种表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白重组BHK细胞系是BCSFV-E012。本发明还公开了制备所述重组BHK细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防猪瘟疫苗以及猪瘟诊断试剂中的应用。属于生物医药基因工程与免疫学领域。 

背景技术

猪瘟（Classical swine fever,CSF）又称猪霍乱（Hog cholera,HC）是由猪瘟病毒（Hog Cholera virus,HCV或Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性热性致死性疾病，猪瘟具有高度接触传染性，流行广泛，发病与死亡率高，危害极大。国际兽疫局(OIE)以前将其定为A类传染病，现将期列为通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。 

在中国全国范围内都有猪瘟发病流行，对养猪业危害极大。目前对该病的有效防措施为疫苗免疫预防。其中由中国科学家研究成功的猪瘟弱毒疫苗（C株）对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被我国等多个国家使用。而且由此弱毒株的基础上开发出了乳兔苗，免脾淋苗，原代细胞苗及传代细胞苗等多种形式的弱毒疫苗。但组织苗的生产需要大量健康动物，生产过程中人工劳动强度大，成本高，有接种副反应等等这些不利因素影响了此类疫苗的实际应用。而以培养细胞繁殖弱毒生产疫苗同样也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中BVDV及抗体会干扰病毒生长，病毒抗原滴度难以提高，弱毒疫苗需要全程冷链保藏等等均导致弱毒疫苗的最终使用效果受到影响。而且所有弱毒疫苗在实际合用过程中均易受母源抗体影响，这也是导致免疫失败的因素之一。 

那么随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗，昆虫杆状病毒表达的E2蛋白 亚单疫苗，大肠杆菌表达蛋白的亚单位疫苗等等。其中至目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。 

CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个含3898个氨基酸残基的多聚蛋白，分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其多聚蛋白上从N疫到C端的顺序依次为：Npro、C、E0(Erns)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除C、E0、E1和E2为结构蛋白外．其余均为非结构蛋白。结构蛋白的加工是由宿主细胞的信号肽酶介导进行的，蛋白酶首先在核衣壳蛋白C和E012前体之间剪切多聚蛋白，随后在E2的C端剪切开，最后E012被迅速剪切成E01和E2。在E2从E012前体释放以后，E01被加工成E0和E1，最后这3种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物，组装成病毒粒子结构。 

猪瘟病毒的基因组结构与其它黄病毒如乙型脑炎病毒等黄病毒有着某些相似的特点。基因组都是编码一个大的多聚蛋白前体后经剪切加工形成结构蛋白与非结构蛋白。已知如JEV等黄病毒的结构蛋白基因在哺乳动物细胞内表达能组装形成病毒样颗粒（virus like particle,VLP）结构。VLP抗原具有接近于病毒粒子的天然结构构象，能诱导机体产生体液免疫与细胞免疫。且不含病毒核酸，不能复制，无致病性，安全性高，所有这些优点使得表达VLP抗原是制备新型病毒病疫苗的首选。那么猪瘟病毒的结构蛋白在哺乳动物细胞内表达后能不能形成VLP结构目前还没有报道。本研究室近年来开展了以哺乳动物细胞系表达不同黄病毒细胞蛋白基因。本研究组在本发明中探索了不同表达细胞系并最终找到合适表达细胞系，克服了表达黄病毒膜蛋白对细胞的毒性作用，并建立了大规模筛选等技术，结果成功制备了表达猪瘟病毒结构蛋白细胞系，而且表达蛋白能组装成病毒样颗粒结构。该细胞系表达VLP抗原能对免疫猪诱导产生良好的免疫反应。同时该抗原表达量高，易于纯化，可以用作CSFV抗体检测的抗原。该细胞系表达抗原所制备的疫苗可望为猪瘟的预防提供新型、高效的预防制剂。对我国及至世界范围内猪瘟的预防控制可以发挥重要作用。 

发明内容